Questo protocollo è un estratto da Kelly et al., Dissezione e colorazione immunofluorescente del corpo del fungo e dei neuroni fotorecettori nei cervelli adulti di Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
1. Preparazione della stazione di dissezione
- Posizionare lo stereomicroscopio e la sorgente luminosa con i colli d'oca in fibra ottica attaccati su un ampio piano di lavoro. Per favorire movimenti costanti della mano e ridurre il "tremore" della mano durante la dissezione, è essenziale che sia disponibile un adeguato spazio per il poggiamani e le braccia intorno al microscopio. Assicurarsi che ci siano circa 8 - 10 pollici su entrambi i lati del microscopio e 4 - 6 pollici tra la base del microscopio e il bordo del banco.
- Riempire 2 o 3 pozzetti di una piastra di vetro a 9 o 3 pozzetti con 1,0 mL di tampone PTN (tampone fosfato di sodio 0,1 M pH 7,2, tensioattivo non ionico allo 0,1%, vedere la Tabella dei materiali per i componenti completi del tampone) e posizionarlo accanto alla stazione di dissezione su ghiaccio. I cervelli appena sezionati saranno trasferiti in questa piastra e conservati fino alla fase di fissazione.
NOTA: Se è necessaria l'imaging dal vivo, il tampone di dissezione deve essere 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o tampone HL3. Se è richiesta la localizzazione intracellulare delle proteine, la PBS può essere utilizzata anche come tampone alternativo per la dissezione e la fissazione. Dopo la fissazione, la permeabilizzazione delle membrane cellulari deve essere eseguita utilizzando lavaggi PTN contenenti lo 0,1% o lo 0,3% di detergente non ionico.
- Se il PBS viene utilizzato per le dissezioni e il fissaggio, i puntali delle pipette devono essere risciacquati almeno una volta con un tampone contenente detergente (come il PTN) per evitare che il cervello si attacchi ai puntali delle pipette in plastica durante il trasferimento alle provette per microcentrifuga.
- Utilizzando una capsula di Petri vuota di vetro o plastica da 35 mm, costruire una capsula di dissezione contenente un elastomero siliconico. Brevemente, mescolare i componenti dell'elastomero secondo le indicazioni del produttore, versare in piatti da 35 mm e lasciarlo polimerizzare per una notte su una superficie piana. Le piastre di dissezione contenenti elastomero devono essere utilizzate per proteggere le punte sottili delle pinze da dissezione, che possono essere facilmente danneggiate se viene effettuato il contatto tra le pinze e una superficie più dura, come una capsula di vetro. Inoltre, acquistiamo regolarmente piatti rivestiti in silicone disponibili in commercio dai rivenditori online. Per aumentare il contrasto durante le dissezioni, le piastre di dissezione in elastomero siliconico contenenti carbone inattivo (e quindi colorate di nero) sono particolarmente utili.
2. Procedura di dissezione cerebrale adulta
- Anestetizzare D. melanogaster adulto di 3 - 5 giorni con CO2 o utilizzando ghiaccio. Se si utilizza il ghiaccio, posizionare la fiala contenente le mosche capovolte (l'estremità del tappo rivolta verso il basso) in un secchiello del ghiaccio per ~5 minuti. Mettere la fiala nel ghiaccio a testa in giù impedisce alle mosche di rimanere incastrate nel cibo. Una volta che le mosche sono state anestetizzate, posizionare le mosche su un cuscinetto di metallo freddo o su una capsula di Petri immersa nel ghiaccio o su un cuscinetto per mosche che emette CO2. Se si sezionano cervelli per analizzare la neurodegenerazione, possono essere utilizzati anche moscerini più vecchi.
- Posizionare una piccola quantità (150 - 200 μL) di PTN al centro del piatto di dissezione utilizzando una pipetta di trasferimento o una pipetta p200 per creare una "bolla" di PTN. Posizionare il piatto di dissezione sotto lo stereomicroscopio e regolare l'illuminazione e la messa a fuoco in modo che la bolla di PTN riempia il campo visivo e sia illuminata in modo uniforme.
- Manipola le mosche in modo che siano "a pancia in su" (cioè con il lato ventrale rivolto verso l'alto) mentre sono sdraiate sul cuscinetto di metallo o CO2.
- Usando un paio di pinze #5, afferrare l'addome di una mosca da sezionare e, tenendo la mosca, immergerla completamente nel PTN sul piatto di dissezione.
NOTA: Per il resto del protocollo, tutti i passaggi devono essere eseguiti mentre la testina è immersa nel PTN.
- Usando un secondo paio di pinze #5, afferra la base della proboscide della mosca e separa le due paia di pinze per staccare la testa della mosca dal corpo. Scartare l'addome e il torace. Durante questa fase, è fondamentale che la testa non venga rilasciata e lasciata galleggiare sulla superficie del PTN. Una volta che la testa galleggia, può essere molto difficile afferrarla di nuovo senza schiacciare il cervello><.
NOTA: Usando questo metodo, le connessioni tra il cervello e il cordone nervoso ventrale vengono recise. Se sono necessarie connessioni intatte tra queste regioni del SNC, è necessario seguire un protocollo di dissezione alternativo. Se la proboscide si stacca dalla testa della mosca prima che la testa venga rimossa, ci sarà un foro dove si trovava la proboscide. In questo caso, afferrare la testa della mosca sul bordo del foro vicino a un occhio. Quindi rimuovere la testa usando una forza moderata mentre si separano le due paia di pinze l'una dall'altra. Occasionalmente, quando la testa viene rimossa dal corpo, l'intestino e/o il cordone nervoso ventrale rimangono attaccati alla testa e devono essere rimossi prima di continuare la dissezione.
- Mentre un paio di pinze afferra la proboscide, il secondo paio dovrebbe afferrare il bordo mediale dell'occhio destro della mosca. Lentamente, separa le pinze l'una dall'altra. Questo passaggio deve essere eseguito con una piccola quantità di forza laterale costante. Mentre le pinze si allontanano lentamente l'una dall'altra, la proboscide dovrebbe staccarsi dalla testa e creare un foro centrale nella cuticola della testa. Scartare la proboscide con il primo paio di pinze senza rilasciare la porzione mediale dell'occhio destro dal secondo paio.
NOTA: Il cervello adulto di D. melanogaster si trova nella regione caudale (cioè posteriore/posteriore) della testa della mosca. Pertanto, si dovrebbe evitare di afferrare quella regione della testa. Idealmente, solo la parte rostrale (cioè anteriore) della testa vicino alla retina mediale dovrebbe essere afferrata direttamente dal forcipe. Il cervello e la trachea associata dovrebbero ora essere visibili attraverso il foro centrale nella cuticola. A questo punto, eventuali fili filamentosi bianchi della trachea che sporgono dal foro possono essere rimossi e scartati.
- Con il secondo paio di pinze, afferrare il bordo mediale della retina sinistra (al bordo del foro centrale nella cuticola della testa). Per rimuovere la retina e la cuticola associata, allontanare lentamente le pinze l'una dall'altra con un angolo di 180°. Quando la retina si dissocia dal lobo ottico sottostante, si dovrebbe avvertire una leggera diminuzione della tensione. Procedere lentamente per evitare di strappare il lobo ottico.
NOTA: Separare la pinza troppo rapidamente durante questa fase può provocare la lacerazione del lobo ottico o la rottura delle strutture corporee a fungo. Occasionalmente, la cuticola verrà rimossa ma pezzi di retina rimarranno attaccati al lobo ottico. Se si esegue l'imaging dei corpi dei funghi, non è completamente necessario rimuovere l'intera retina. Tuttavia, l'analisi di altre regioni cerebrali (come l'innervazione dei neuroni retinici dei lobi ottici del cervello) può richiedere la rimozione completa della retina come descritto da.
NOTA: Poiché la retina viene lentamente separata dal lobo ottico sottostante del cervello, il lobo ottico dovrebbe essere osservabile come una struttura bianca opaca ricoperta da trachea bianca e filamentosa. Una volta che una retina è stata rimossa, può essere scartata. Quando si analizza il pathfinding dei neuroni retinici, è necessario prestare particolare attenzione durante questa fase per prevenire danni al lobo ottico. È disponibile anche un protocollo aggiuntivo incentrato sulla dissezione e sull'imaging dal vivo dei neuroni fotorecettori.
- Ora, rimuovi con cura la maggior parte della trachea visibile. La trachea può già contenere o successivamente riempirsi d'aria, causando la fluttuazione del cervello e, potenzialmente, la perdita durante le successive fasi di immunocolorazione. Per rimuovere la trachea, raccoglila dal cervello usando un paio di pinze #5 molto affilate.
- Rimuovere la retina rimanente e la cuticola circostante utilizzando entrambe le paia di pinze per afferrare la regione mediale della retina della mosca sinistra. Strappare con cura la retina a metà per rimuovere pezzi di retina e cuticola. In alcuni casi, rimuovere la cuticola rimanente senza schiacciare il cervello si rivela particolarmente impegnativo. In questi casi, abbiamo scoperto che i filamenti rimanenti del cordone nervoso ventrale possono invece essere afferrati da un paio di pinze mentre l'altro paio di pinze viene utilizzato per rimuovere con cura l'ultima cuticola.
- Utilizzando una pipetta p200, spostare i cervelli sezionati in un pozzetto della piastra a 9 o 3 pozzetti contenente PTN. I cervelli dello stesso genotipo dovrebbero essere raggruppati nello stesso pozzetto e mantenuti in ghiaccio. Il tessuto cerebrale deve essere fissato entro un'ora dalla dissezione. I cervelli possono essere fissati in piccoli lotti e raggruppati se è necessario un numero maggiore di cervelli. Nella maggior parte dei casi, un ricercatore esperto di solito può sezionare un cervello e trasferirlo nella capsula di raccolta in vetro in circa 3-5 minuti.
