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Questo protocollo è un estratto da Koyle et al., Allevamento del moscerino della frutta Drosophila melanogaster in condizioni assiniche e gnotobiotiche, J. Vis. (2016).
1. Uova dechorionate e trasferimento a dieta sterile
- Preparare la cabina di biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con etanolo al 70%. Pulire il fondo con un fazzoletto da laboratorio e sterilizzare la cappa con luce UV per ~15 minuti. Sterilizzare tutte le forniture non biologiche (coppette per campioni, pennello, pinze, contenitore per rifiuti, 400 ml di acqua sterilizzata e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%) spruzzando con etanolo e posizionandole immediatamente nella cabina di biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 min.
- Iniziare il primo dei 2 lavaggi con ipoclorito di sodio posizionando la boccola con le uova in una tazza per campioni da 120 ml o in un altro contenitore sterile. Versare lentamente ~90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
- Sciacquare le uova per 2,5 minuti. Risospendere periodicamente le uova usando una pinza per muovere la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
- Trasferire la boccola direttamente in una seconda tazza per campioni, pre-riempita con 90 ml di candeggina, all'interno della cabina di biosicurezza.
- Ripetere il passaggio 1.3 all'interno della cabina di biosicurezza. Al termine del secondo trattamento di candeggina, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
- Eseguire i passaggi 1.7-1.8 nella cabina di biosicurezza.
- Scartare la candeggina e lavare la boccola con acqua sterile 3 volte. Risospendere le uova più volte durante ogni lavaggio muovendo la boccola con una pinza. Entro la fine del terzo lavaggio, la maggior parte delle uova dovrebbe essere attaccata al lato della boccola.
- Utilizzando un pennello sterilizzato in etanolo, trasferire le uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Punta a 30-50 uova per fiala. Lasciare i tappi allentati per consentire all'ossigeno di entrare nel tubo. Se le fiale devono rimanere assiniche, trasferirle in un'incubatrice per insetti; In caso contrario, aggiungere i batteri come di seguito.
2. Crea mosche gnotobiotiche usando 4 specie batteriche
- Preparare i batteri
- Preparare una cappa di biosicurezza sterilizzata con le forniture necessarie (pipette, scatole di puntali per pipette, provette da centrifuga sterilizzate, brodo MRS e rack per provette) come al punto 1.1. Pulire l'esterno delle provette con una salvietta da laboratorio imbevuta di etanolo prima di metterla nella cabina di biosicurezza.
- Pellettare i batteri trasferendo prima 500 μl di crescita notturna in una provetta sterile per microfuge. Se la densità batterica è bassa, aggiungere fino a 1,5 ml a ciascuna provetta o rimuovere in sequenza il surnatante e aggiungere ulteriore coltura alla stessa provetta. Rimuovere i campioni dalla cabina di biosicurezza e centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g. Utilizzare i puntali dei filtri per evitare la contaminazione tra i campioni.
- Determinare la densità di ciascuna coltura misurando OD600. Se si utilizza un lettore di piastre a più pozzetti, trasferire 200 μl di ciascuna coltura in una piastra a 96 pozzetti in diluizioni di 1, 2 e 4 volte.
- Determinare la quantità di mMRS in cui diluire ciascun pellet cellulare (2.1.2) utilizzando uno spettrofotometro a lettura di piastre e le seguenti equazioni. Pianificare di aggiungere abbastanza brodo per inoculare 50 μl in ogni fiala di mosca.
- Raccogli le letture OD600 per una diluizione 1:1, 1:2 e 1:4 di ciascuna coltura batterica su uno spettrofotometro a lettura di piastre. Selezionare la diluizione per ciascun ceppo batterico che produce un valore di OD600 compreso tra 0,1 e 0,2 e utilizzare questo valore e il fattore di diluizione corrispondente come «O» e «D» nelle formule fornite in 2.1.4.2 o 2.1.4.3.
- Se si utilizzano le 4 specie qui descritte, normalizzare le cellule a densità equivalenti di unità formanti colonie (CFU)/ml (conversione da OD600 a CFU determinata in precedenza in Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol). (2014)) utilizzando questa equazione:
E = ((O-B) x V x D)/C
dove E = volume in cui risospendere il pellet (μl), O = batteri OD600, B = terreno bianco OD600, D = diluizione pieghevole, V = μl coltura batterica prima della centrifugazione, C = OD600 della costante predeterminata. Vedere File di codice supplementare per esempi di calcoli che utilizzano queste equazioni. Per gli spettrofotometri che si svuotano automaticamente, utilizzare "O" al posto di "O-B".
NOTA: Le costanti predeterminate (unità OD600, normalizzate a 107 CFU ml-1, costanti derivate in Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) sono i seguenti: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- Se si utilizzano altre specie batteriche (non è disponibile alcuna costante CFU/OD600), normalizzare la densità a OD600 = 0,1 utilizzando questa equazione:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
NOTA: Le unità sono le stesse del passaggio 2.1.4.2. Vedere File di codice supplementare per esempi di calcoli che utilizzano queste equazioni.
- Nella cappa di biosicurezza, rimuovere il surnatante con una punta di pipetta e risospendere il pellet in mMRS o PBS fresco come calcolato al punto 2.1.4.2.
- Inoculare i batteri
- Trasferire 50 μl di batteri nelle provette coniche con dieta sterile e uova decorionate in cabina di biosicurezza. Aggiungere batteri dopo il trasferimento degli ovuli per evitare la contaminazione tra le fiale.
- Porre le provette inoculate in un'incubatrice a 25 °C.
3. Misura il carico di UFC/Test di sterilità
- Per misurare il carico di CFU in omogeneizzati di mosca di tutto il corpo, trasferire 5 mosche (5-7 giorni dopo l'eclosione) in una provetta per microfuge da 1,7 ml contenente 125 μl di perle di ceramica e 125 μl di brodo mMRS. Omogeneizzare le mosche utilizzando un omogeneizzatore tissutale per 30 secondi a 4,0 M/sec.
- In alternativa, omettere le perle e omogeneizzare a mano in provette da microcentrifuga con pestelli di plastica per 1 minuto.
- Se si quantifica il microbiota intestinale, sterilizzare in superficie i moscerini per rimuovere i microbi esogeni. Trasferire le mosche in una provetta da microcentrifuga contenente 100 μl di etanolo al 70% per 1 minuto, aspirare l'etanolo e trasferirle in una nuova provetta da microcentrifuga per omogeneizzazioni. Se si intende misurare il contenuto di DNA nell'intestino, sciacquare per 1 minuto con ipoclorito di sodio allo 0,6% prima del lavaggio con etanolo.
- Diluire l'omogenato con 875 μl di mMRS, agitare per 5 secondi e pipettare 120 μl di omogenato nel primo pozzetto di una piastra per microtitolazione.
- Eseguire due diluizioni sequenziali 1:8 utilizzando 10 μl di omogenato e 70 μl di MRS nei due pozzetti successivi.
- Prelevare 10 μl dal primo pozzetto e aggiungerlo al secondo pozzetto contenente 70 μl di MRS. Mescolare accuratamente il contenuto del secondo pozzetto, trasferire 10 μl dal secondo pozzetto al terzo pozzetto contenente 70 μl di MRS e mescolare accuratamente. Questo porta a 3 concentrazioni totali dell'omogeneizzato originale da 1.000 μl: non diluito, 1:8 e 1:64.
- Trasferire 10 μl di ciascuna diluizione in una piastra mMRS (utilizzando una pipetta multicanale, se lo si desidera). Inclinare leggermente il piatto per distribuire la diluizione di diversi millimetri lungo la superficie dell'agar e lasciare asciugare il liquido prima di spostare il piatto. Il liquido si asciuga rapidamente sulla piastra se le piastre hanno 2 giorni, riducendo la miscelazione di due goccioline vicine.
- Incubare a 30 °C per 1-2 giorni. Rimuovere le piastre dall'incubatrice una volta distinte, le singole colonie sono visibili e contare da una diluizione con 10-100 colonie isolate.
- Calcolare i CFU per mosca utilizzando l'equazione E = C x D/P x V/F, dove E = CFU per mosca, C = numero di colonie contate, D = diluizione, P = μl placcato, V = volume di mosca omogeneizzata e F = numero di mosche omogeneizzate.