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Abstract

Fonte: Guan, W., et al. Visualizza gli assoni dei motoneuroni delle gambe di Drosophila attraverso la cuticola adulta. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive un metodo per sezionare, fissare e montare la zampa adulta di Drosophila preservando intatta la sua neuromuscolatura per l’analisi di imaging.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axon Through the Adult Cuticle, J. Vis.(2018).

1. Dissezione e fissazione delle gambe

1. Prendi una piastra multipozzetto di vetro e riempi un numero appropriato di pozzetti con il 70% di etanolo. Aggiungere 15-20 mosche anestetizzate con CO₂ (di entrambi i sessi e di qualsiasi età) in ciascun pozzetto e, utilizzando un pennello, tamponare delicatamente le mosche nella soluzione di etanolo fino a quando le mosche non sono completamente sommerse.
   NOTA: Questo passaggio consiste nel rimuovere l’idrofobicità della cuticola. Non lavare per più di 1 minuto, perché questo aumenta l’autofluorescenza della cuticola.
2. Sciacquare le mosche 3 volte con una soluzione detergente di tensioattivo non ionico allo 0,3% in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Tenere le mosche in questa soluzione per almeno 10 min.
   NOTA: Le gambe sono meglio fissate quando si include il detersivo, che è probabile che aumenti la penetrazione del fissativo all’interno della gamba.
3. Posizionare una piastra a più pozzetti sul ghiaccio insieme a un tubo di paraformaldeide al 4% (PFA).
   NOTA: La preparazione di PFA fresco al 4% da una soluzione madre priva di etanolo al 16% è fondamentale.
4. Usa una pinza per rimuovere la testa e l’addome delle mosche senza danneggiare il segmento toracico o le zampe.
   NOTA: La rimozione dell’addome rende più facile tenere la mosca e sezionare le zampe.
5. Sezionare le gambe dal segmento toracico con una pinza e posizionare le gambe nei pozzetti contenenti il 4% di PFA. Per questo, spingere delicatamente ma con fermezza la giunzione coxa-torace usando la punta di una pinza sottile fino a quando la gamba non si stacca.
6. Fissare le gambe in PFA al 4% per una notte a 4 °C (circa 20 ore in totale).
7. Lavare le gambe con una soluzione detergente di tensioattivo non ionico allo 0,3% in 1x PBS, 5x per 20 min ciascuna.
8. Sostituire il tampone di lavaggio con il mezzo di montaggio. Tenere la gamba nel mezzo di montaggio per almeno un giorno prima del montaggio per consentirne la completa penetrazione nella gamba.
   NOTA: Se il mezzo di montaggio è molto viscoso, diluire il mezzo di montaggio all’80% con 1x PBS perché l’improvviso cambiamento di viscosità può causare il collasso della cuticola e danneggiare la struttura complessiva della gamba. A seconda del driver Gal4, le mosche possono essere conservate da 1 a 3 settimane a 4 °C in mezzi di montaggio fino al montaggio.

2. Montaggio delle gambe

1. Posizionare circa 20 μl di glicerolo al 70% sul lato sinistro di un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino coprioggetti quadrato di 22 x 22 mm² (Figura 1A,B). Pipettare circa 10 μl di terreno di montaggio lungo una linea parallela e a una piccola distanza dal bordo destro di questo vetrino coprioggetti. Aggiungere altri 30 μl di mezzo di montaggio sul lato destro del vetrino (Figura 1C).
   NOTA: Quando si applica un vetrino coprioggetti sulle gambe (vedere di seguito), il mezzo di montaggio si diffonderà delicatamente sotto il vetrino coprioggetti e intorno alle gambe senza spostarle.
2. Usando una pinza fine, sollevare la gamba dalla soluzione e posizionarla delicatamente sul mezzo di montaggio vicino al vetrino coprioggetti sinistro. Fai lo stesso per ogni gamba e allineale dall’alto verso il basso (Figura 1D).
   1. Sollevare e trasferire le gambe in una goccia di terreno trattenuta tra le due punte della pinza. Orientare le gambe in due modi: con il lato esterno verso l’alto o verso il basso.
3. Una volta che tutte le gambe (fino a 6-8 gambe possono essere montate) sono correttamente allineate, mettere un secondo vetrino coprioggetti sulle gambe in modo tale che questo vetrino coprioggetti poggi leggermente sul vetrino coprioggetti precedentemente posizionato Figura 1E per lasciare spazio tra il vetrino coprioggetti e il tessuto e per evitare che le gambe vengano danneggiate (Figura 1G).
   NOTA: In alternativa, utilizzare pozzetti adesivi o cera ortodontica per creare spazio tra il vetrino coprioggetti e il vetrino.
4. Usa uno smalto per unghie per fissare la posizione dei vetrini coprioggetti ad ogni angolo (Figura 1F).
   NOTA: Il tessuto è ora pronto per l’immagine.

Representative Results

Materials

Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium