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Questo protocollo è tratto da Radford e McKim, Tecniche per l'imaging della prometafase e della metafase della meiosi I negli ovociti fissi di Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
NOTA: Le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato. Le incubatrici a temperatura controllata vengono utilizzate per mantenere le temperature per l'allevamento di mosche e gli incroci, se non diversamente specificato.
1. Preparativi
- Prepara le mosche.
- Raccolte di ovociti arricchite con prometafase.
- Elimina le mosche adulte da ceppi sani e giovani o da colture incrociate. Affinamento in bottiglia per due giorni a 25 °C.
NOTA: In generale, due bottiglie sane saranno sufficienti, anche se potrebbero essere necessarie di più per alcune culture incrociate.
- Dopo due giorni, raccogli da ~ 100 a 300 femmine (che a questo punto hanno da 0 a 2 giorni) dalle bottiglie. Le femmine non hanno bisogno di essere vergini. Aggiungi una piccola quantità di pasta di lievito sul lato di una fiala e metti 30 femmine e da 10 a 15 maschi ciascuno nelle fiale lievitate. Affinare le fiale per due giorni a 25 °C.
- Raccolte di ovociti arricchite in metafase.
- Raccogli da ~100 a 300 femmine da stock o culture incrociate. Aggiungere una piccola quantità di pasta di lievito sul lato di una fiala e mettere 30 femmine ciascuna (senza l'aggiunta di maschi) nelle fiale lievitate. Invecchiare le fiale da tre a cinque giorni a 25 °C.
- Preparare le soluzioni.
NOTA: Le soluzioni possono essere conservate a tempo indeterminato a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
- Preparare il tampone di Robb modificato (5x): 500 mM di HEPES, 500 mM di saccarosio, 275 mM di acetato di sodio, 200 mM di acetato di potassio, 50 mM di glucosio, 6 mM di cloruro di magnesio e 5 mM di cloruro di calcio. Utilizzare 10 N 11:8 idrossido di sodio:idrossido di potassio per portare il pH a 7,4. Sterilizzare per filtrazione; Non sterilizzare in autoclave. Conservare a -20 °C. Scongelare se necessario per preparare ~200 ml di 1x Robb's per preparazione di ovociti.
- Soluzioni di fissaggio.
- Opzione #1: Preparare la fissazione formaldeide/eptano. Preparare il tampone di fissaggio: 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) più 150 mM di saccarosio. Per l'uso, preparare fresco con 687,5 μl di tampone di fissazione e 312,5 μl di formaldeide al 16% per preparazione di ovociti
cautela: Indossare i guanti durante l'utilizzo di soluzioni di formaldeide in una cappa aspirante. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali.
- Opzione #2: Preparare la fissazione formaldeide/cacodilato. Preparare Fix Mix: 250 mM di saccarosio, 100 mM di acetato di potassio (pH 7,5), 25 mM di acetato di sodio (pH 7,0) e 25 mM di EGTA (pH 8,0). Per l'uso, preparare fresco con 400 μl di Fix Mix, 100 μl di cacodilato di potassio (1 M, pH 7,2) e 500 μl di formaldeide al 16% per preparazione di ovociti
cautela: Il cacodilato di potassio contiene arsenico.
- Preparare PBS/Triton X-100: 1x PBS più 1% o 0,05% di Triton X-100. Conservare a 4 °C.
- Preparare l'albumina sierica bovina (BSA) (PTB) PBS-Tween 20-Tween: 1x PBS, 0,5% BSA (p/v) e 0,1% Tween-20. Può essere conservato a 4 °C per una settimana.
2. Raccolta di ovociti di Drosophila in stadio avanzato
- Poiché gli ovociti di Drosophila con le membrane intatte si attaccano alla plastica e al vetro, pre-rivestire l'interno di una provetta da 5 ml e una pipetta Pasteur per ogni preparazione di ovociti con PTB.
- Anestetizzare tutte le ~100-300 mosche lievitate con anidride carbonica e aggiungerle a un frullatore contenente ~100 ml di 1x Robb's Buffer. Pulsare tre volte (~1 sec ciascuna). Mantieni gli ovociti in Robb per <20 minuti per evitare l'attivazione.
NOTA: In alternativa, gli ovociti possono essere sezionati a mano da femmine. Il vantaggio di questo metodo è che richiede meno femmine. Tuttavia, è necessario prestare attenzione a limitare l'esposizione all'anidride carbonica a pochi minuti per evitare artefatti associati all'ipossia.
- Filtrare attraverso maglie larghe (~1.500 μm) in un becher da 250 ml per rimuovere le parti del corpo di grandi dimensioni. Se sulla rete rimangono molti addomi intatti, macinare nuovamente il materiale utilizzando un ulteriore Robb's Buffer e filtrare nuovamente. Lasciare riposare ~2 minuti, quindi aspirare lo strato superiore, rimuovendo il maggior numero possibile di parti del corpo più grandi.
- Filtrare attraverso maglie piccole (~300 μm) in un becher da 250 ml. Sciacquare gli ovociti rimanenti dal primo becher utilizzando un'altra pipetta Robb's e Pasteur rivestita. Lasciare riposare ~3 min; Gli ovociti si depositeranno. Aspirare tutti tranne ~10 ml.
- Versare la quantità di 10 ml che si adatta al tubo da 5 ml rivestito. Lasciare riposare, rimuovere il liquido e ripetere con il resto. Sciacquare gli ovociti rimanenti dal becher utilizzando un'altra pipetta Robb's e Pasteur rivestita. Lasciare riposare in tubo da 5 ml per ~3-5 min.
3. Trattamenti farmacologici (opzionale)
- Rivestire una seconda provetta da 5 ml con PTB per ogni preparazione di ovociti. Aggiungere un solvente appropriato (controllo) o un farmaco a 1 ml di Robb ciascuno per ogni preparazione di ovociti (Tabella 1).
- Dividere gli ovociti in una seconda provetta da 5 ml rivestita. Lasciare depositare, rimuovere il liquido e aggiungere 1 ml di solvente Robb's plus in un tubo e 1 ml di farmaco Robb's plus nel secondo tubo. Nutato per un periodo di tempo adeguato per il trattamento farmacologico (Tabella 1). Lasciamolo riposare.
4. Fissazione
- Aspirare tutto il liquido e aggiungere immediatamente 1 ml di Fix.
- Opzione #1: Fissazione formaldeide/eptano (tampone di fissazione più 5% di formaldeide).
- Fissare per 2,5 minuti su un nutatore. Aggiungere 1 ml di eptano e vortice per 1 minuto. Lasciare riposare ~1 min.
- Rimuovere tutto il liquido, quindi aggiungere 1 ml di 1x PBS. Vortice 30 sec. Lasciare riposare ~1 min.
- Rimuovere tutto il liquido, quindi riempire il tubo con 1x PBS.
NOTA: Gli ovociti possono essere utilizzati immediatamente o conservati sul nutatore per diverse ore a temperatura ambiente.
- Opzione #2: Fissazione formaldeide/cacodilato (Fix Mix più 8% di formaldeide e 100 mM di cacodilato).
- Fissare per 6 minuti su un nutatore. Lasciare riposare 2 min. Rimuovere il liquido, quindi riempire il tubo con 1x PBS.
NOTA: Gli ovociti possono essere utilizzati immediatamente o conservati sul nutatore per diverse ore a temperatura ambiente.
5. Rimozione delle membrane ("rotolamento")
- Utilizzando la pipetta Pasteur rivestita, aggiungere da ~ 500 a 1.000 ovociti alla parte smerigliata (sabbiata) di un vetrino. Rimuovere tutte le parti del corpo e il materiale estraneo utilizzando una pinza. Non lasciare che gli ovociti si secchino; aggiungere 1x PBS se necessario.
- Posizionare un vetrino coprioggetti sopra gli ovociti e "arrotolare" delicatamente gli ovociti fino a rimuovere tutte le membrane (trascinare il bordo del vetrino coprioggetti sugli ovociti funziona meglio). Controllare periodicamente i progressi al microscopio, aggiungendo più PBS 1x se necessario. Fai attenzione perché troppa pressione distruggerà gli ovociti.