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Questo protocollo è un estratto da Perkins e Bickel, utilizzando l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per monitorare lo stato di coesione del braccio negli ovociti di Drosophila in prometafase e metafase I, J. Vis. Exp. (2017).
1. Rimozione dei corioni e delle membrane vitelline
NOTA: Vedi Figura 1 per gli strumenti necessari.
- Separare gli ovociti in fase avanzata
- Aggiungere 1 ml di PBSBTx in un piatto di dissezione poco profondo. Utilizzare un P200 con punta rivestita in BSA per trasferire le ovaie fisse (in ~150 μL) nel piatto poco profondo. Pipettare le ovaie su e giù con la punta della pipetta rivestita di BSA per rimuovere gli ovociti maturi dagli ovociti meno maturi.
- Quando gli ovociti in fase avanzata sono sufficientemente separati, trasferire tutto il tessuto in una provetta per microfugo da 500 μl. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta Pasteur tirata, lasciando circa 150 - 200 μl nella provetta. Ripetere la sezione 1.1 per i genotipi rimanenti.
- Preparati per il rotolamento
- Pre-bagnare una capsula a pozzetti profondi con 200 μl di PBSBTx. Coprire e mettere da parte. Procuratevi 3 vetrini smerigliati e mettete da parte il vetrino #3. Strofinare delicatamente le regioni di vetro smerigliato dei vetrini #1 e #2. Sciacquateli in acqua deionizzata per rimuovere eventuali schegge di vetro e asciugateli con una salvietta usa e getta.
- Rivestire le regioni smerigliate dei vetrini #1 e #2 con PBSBTx aggiungendo 50 μL di PBSBTx a un vetrino e strofinando questa regione con l'altro vetrino. Rimuovere il liquido con una salvietta usa e getta.
- Posizionare i vetrini sotto un microscopio da dissezione nella configurazione mostrata in Figura 2A. Mantenere a contatto le regioni smerigliate delle diapositive #1 e #2, con la diapositiva #3 che supporta la diapositiva #2.
- Arrotolare gli ovociti; assicurarsi che la direzione di rotolamento sia sempre in linea retta e mai con un movimento circolare.
- Preinumidire un puntale per pipetta P200 in PBSBTx e disperdere gli ovociti nella provetta per microfugi pipettando su e giù. Trasferire 50 μL di liquido contenente ovociti al centro della parte in vetro smerigliato del vetrino #1. Solleva lo scivolo #2 per fare ciò.
- Abbassare lentamente il vetrino #2 fino a quando la tensione superficiale del liquido crea una tenuta tra le due regioni di vetro smerigliato. Dovrebbe esserci abbastanza liquido per coprire l'area ghiacciata, ma non dovrebbe fuoriuscire. Se il liquido trabocca, utilizzare una pipetta Pasteur tirata per rimuovere il liquido in eccesso.
- Tenere in posizione la diapositiva inferiore (#1) con una mano e utilizzare l'altra mano per spostare la diapositiva superiore (#2) avanti e indietro in direzione orizzontale, mantenendo la diapositiva #2 in piano e supportata dalla diapositiva #3. Eseguire al microscopio per una facile visualizzazione dei movimenti e dei progressi degli ovociti.
NOTA: Questo movimento genererà attrito e farà "rotolare" gli ovociti e perdere i loro corioni. Dovrebbe essere esercitata una pressione minima e i movimenti dovrebbero essere brevi e rapidi.
- Dopo alcuni movimenti in direzione orizzontale, modificare leggermente l'angolo di movimento (Figura 2B). Con incrementi multipli, aumentare gradualmente questo angolo fino a 90° fino a quando il movimento della slitta superiore è perpendicolare alla direzione iniziale (Figura 2B). Si noti che i corioni vuoti saranno visibili nel liquido e gli ovociti privi di corioni appariranno più lunghi e più sottili.
- Ripetere i passaggi 1.3.3 - 1.3.4 circa 7 - 10 volte fino a quando la soluzione diventa leggermente torbida. Smetti di rotolare quando la maggior parte degli ovociti (75-85%) sembra aver perso le membrane vitelline.
NOTA: Un'estremità appuntita distintiva è spesso visibile sugli ovociti privi di membrane vitelline. Le membrane vitelline sono più difficili da rimuovere rispetto ai corioni. È possibile applicare una leggera pressione alla slitta superiore (scivolo #2) durante il rotolamento per ottenere la rimozione delle membrane vitelline. Il tentativo di rimuovere le membrane vitelline da tutti gli ovociti spesso provoca la distruzione di altri ovociti.
- Sollevare delicatamente il vetrino superiore (#2), trascinando uno dei suoi angoli al centro della regione ghiacciata del vetrino inferiore (#1) in modo che gli ovociti arrotolati si accumulino al centro della regione ghiacciata. Sciacquare gli ovociti da entrambi i vetrini con PBSBTx nella vaschetta profonda contenente PBSBTx.
- Pulisci i vetrini #1 e #2 con acqua ultrapura, asciugali con una salvietta usa e getta e ripristinali. Ripetere i passaggi 1.3.1 - 1.3.6 fino a quando tutti gli ovociti dello stesso genotipo sono stati arrotolati. Questo di solito richiede 3-4 cicli di rotolamento per genotipo.
- Rimuovere i detriti dopo il rotolamento
- Aggiungere 1 mL di PBSBTx a una provetta conica da 15 mL. Agitare il liquido per ricoprire i lati del tubo.
- Utilizzando un puntale per pipetta P1000 rivestito con PBSBTx, trasferire gli ovociti arrotolati dal piatto a pozzetti profondi alla provetta conica contenente 1 mL di PBSBTx. Aggiungere altri 2 mL di PBSBTx alla provetta conica contenente gli ovociti.
- Lasciare che gli ovociti inizino a depositarsi sul fondo, quindi rimuovere i 2 mL superiori di soluzione contenente detriti (corioni, vitelline, ecc.) con un P1000 e scartarli. Se necessario, tenere la tuba conica su uno sfondo scuro per vedere gli ovociti opachi mentre affondano.
- Aggiungere altri 2 ml di PBSBTx agli ovociti e ripetere il passaggio 1.4.3. Ripetere 1.4.3. per un totale di 3 cicli di rimozione dei detriti.
- Utilizzando un puntale per pipetta P1000 rivestito con PBSBTx, trasferire nuovamente gli ovociti nella provetta originale da 500 μL di microfugo. 20-25 femmine dovrebbero produrre circa 50 μL di ovociti maturi arrotolati.
- Ripetere la sezione 4 per i genotipi rimanenti utilizzando vetrini freschi glassati, un pozzetto profondo pulito e un nuovo tubo conico per ogni genotipo.
- Se è necessaria la conservazione, trasferire gli ovociti in 1x PBS con TritionX-100 allo 0,1% e conservare per una notte a 4 °C. La conservazione a lungo termine non è consigliata perché la reticolazione della formaldeide può essere invertita da detergenti non ionici.
