Rottura delle cuticole: un metodo per raccogliere l'emolinfa dalle larve di Drosophila

Abstract

Fonte: Reimels, T. A. e Pfleger, C. M. Metodi per esaminare la ghiandola linfatica e gli emociti nelle larve di Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).

L'emolinfa di Drosophila funge sia da sangue che da liquido interstiziale, circolando in tutto il corpo durante gli stadi larvali e adulti. Questo video descrive un protocollo per raccogliere l'emolinfa larvale al fine di quantificare le cellule circolanti.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Reimels e Pfleger, Metodi per esaminare la ghiandola linfatica e gli emociti nelle larve di Drosophila, J. Vis.(2016).

1. Concentrazione di emociti circolanti

1. Per ottenere larve all'incirca dello stesso stadio di sviluppo per questo test, limitare la raccolta delle uova consentendo alle femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2 - 6 ore.
2. Raccogli le larve in pozzetti per piastre di dissezione riempiti con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Per ogni larva, mettere 10 μl di PBS in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio e 10 μl di PBS su un tampone di dissezione pulito. Posizionare il tampone di dissezione su una base illuminata per stereomicroscopio.
4. Asciugare una singola larva posizionandola su una salvietta di fazzoletti prima di trasferirla su una goccia di PBS sul tampone di dissezione.
5. Usando un paio di pinze, strappare delicatamente e capovolgere con cura la cuticola per rilasciare l'emolinfa.
   NOTA: Fare attenzione a non raschiare o colpire la cuticola in quanto ciò potrebbe potenzialmente rilasciare emociti sessili.
6. Utilizzando una pipetta, raccogliere l'emolinfa dal tampone di dissezione. Evitare di raccogliere detriti larvali come il corpo grasso.
7. Aggiungere l'emolinfa in una provetta da microcentrifuga e mescolare pipettando su e giù.
   NOTA: È possibile raccogliere più campioni contemporaneamente e tenerli in ghiaccio per un massimo di un'ora.
8. Facoltativo: mescolare il blu di tripano con il campione di emolinfa in parti uguali per colorare ed escludere le cellule morte. Contare le cellule entro 3 minuti dall'aggiunta del blu di tripano perché è tossico per le cellule.
9. Miscelare il campione pipettandolo su e giù prima di caricare 10 μl in una camera emocitometrica.
10. Se si utilizza un contatore di celle automatizzato, impostare i parametri appropriati per la dimensione e la circolarità delle celle. Ad esempio, è possibile impostare una dimensione minima della cella di 2 μm, una dimensione massima della cella di 22 μm e una circolarità del 75-80% di rotondità per rilevare emociti rotondi normali. Sperimenta con diversi parametri per rilevare emociti più grandi e a forma di fuso, come i lamellociti. In alternativa, utilizzare un emocitometro per contare manualmente gli emociti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Compresse PBS	MP Biomedicali	2810305
piatto di dissezione	Corning	Codice: 7220-85
provetta per microcentrifuga	Denville	Visualizzazione del materiale C2170
tampone da dissezione in silicone, realizzato con il kit Sylgard 184	Krayden (distribuito da Fisher)	NC9644388 (numero di catalogo Fisher)	Realizzato in capsula di Petri mescolando i componenti del kit di elastomeri Sylgard secondo le istruzioni del produttore.
Stereomicroscopio	Morrell Instruments (distributore Nikon)	MNA42000, MMA36300	Modelli Nikon SMZ1000 e SMZ645
salvietta per fazzoletti	VWR	82003-820
forcipe	Scienze della microscopia elettronica	72700-DZ
Pipetta P200	Eppendorf	3120000054
Contacellule automatizzato Countess	Invitrogen	Codice: C10227
Vetrini della camera di conteggio delle cellule Countess	Invitrogen	Codice: C10283
Emocitometro	Hausser Scientific	3200
Trypan macchia blu	Tecnologie per la vita	T10282