Questo protocollo è un estratto da DeAngelis e Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).
1. Preparazione dei tessuti
- Impostare incroci di Drosophila (come descritto in precedenza in Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) o ceppi di Drosophila specifici per ottenere pupe del genotipo desiderato. Per garantire che un gran numero di pupe emerga in modo casuale, stabilire queste colture di mosche in duplicato su terreni alimentari ricchi di sostanze nutritive o su terreni alimentari standard generosamente integrati con pasta di lievito.
- Mantenere le colture di Drosophila a 25 °C. Per gli incroci che utilizzano il sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 è un driver ideale espresso nelle cellule del disco oculare larvale posteriormente al solco morfogenetico e durante lo sviluppo della pupa. L'incrocio UAS-lacZ X GMR-GAL4 funge da incrocio di controllo ideale in quanto guida l'espressione della proteina β-galattosidasi non endogena e inerte.
- Utilizzare la punta di una stecca di bambù da 6 pollici che è stata bagnata con acqua distillata per sollevare delicatamente le pre-pupe bianche (Figura 1B) dal lato delle fiale di coltura sane (Figura 1A) e metterle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml (Figura 1C).
- Posizionare le provette in una scatola di plastica per pipette insieme a un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata per mantenere la camera a un'umidità sufficiente a proteggere le pupe dall'essiccazione (Figura 1D). Incubare le pupe a 25 °C fino alla dissezione.
- Usa una stecca di bambù asciutta da 6 pollici per spingere delicatamente le pupe fuori dalla provetta della microcentrifuga e su un piatto da dissezione nero. Stendere un nuovo pezzo di nastro biadesivo sul piatto di dissezione lontano dalle pupe.
- Usando un paio di pinze, posiziona con cura le pupe con il lato dorsale rivolto verso l'alto (cioè, gli opercoli rivolti verso l'alto, Figura 1B) sul nastro (Figura 2A). Assicurarsi che le pupe aderiscano bene al nastro.
NOTA: L'umidità sulla custodia della pupa inibirà l'adesione sicura al nastro, nel qual caso lasciare asciugare le pupe all'aria prima di posizionarle sul nastro biadesivo.
2. Dissezione dei Complessi Occhio-Cervello
- Usa il forcipe per rimuovere l'opercolo di ogni pupa (Figura 2C).
- Usa le forbici da microdissezione per affettare o tagliare la custodia pupale di ogni pupa. Apri la custodia pupale per rivelare la testa, il torace e il segmento addominale anteriore, fissando i bordi della custodia pupale al nastro biadesivo (Figure 2C).
NOTA: Non è necessario rivelare completamente le pupe.
- Forare l'addome di ogni pupa con una pinza affilata, per afferrare l'animale, e rimuoverlo dal suo involucro pupale (Figura 2C).
- Posizionare le pupe sulla capsula di dissezione nera, lontano dal nastro, e coprire con circa 400 μL di soluzione ghiacciata tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4).
- Afferrare ogni pupa per l'addome con una pinza e, con le forbici da microdissezione, fare un taglio netto in sezione trasversale attraverso l'intero torace, tagliando la pupa a metà (Figura 2D).
- Rimuovere il resto posteriore di ciascuna carcassa dal PBS e metterlo da parte sul piatto di dissezione (non gettarlo, vedere il passaggio 3.2.1).
- Usando due paia di pinze sottili, apri il torace e la testa di ogni pupa per rivelare il complesso occhio-cervello (Figura 2E). Per fare ciò, afferrare i bordi tagliati dell'epitelio toracico e strappare gradualmente per aprire il torace e poi la capsula della testa, esponendo il complesso occhio-cervello e il tessuto adiposo circostante.
- Senza afferrare il tessuto, usa una pinza per guidare il complesso occhio-cervello lontano dai resti della capsula della testa o raccogli il complesso occhio-cervello dalla capsula della testa strappata.
NOTA: Il complesso occhio-cervello è a forma di manubrio, bianco sporco e più traslucido del grasso color crema circostante (Figura 2B,E).
- Con il forcipe, rimuovere con cura la maggior parte del grasso associato ai complessi occhio-cervello senza toccare il tessuto oculare.
3. Trattamento di tessuti per l'immunofluorescenza
- Sezionare almeno 6-10 pupe come descritto (passaggi 2.1-2.9).
NOTA: Tre o quattro repliche indipendenti di ciascuna dissezione tendono a fornire dati sufficienti per testare un'ipotesi.
- Lavaggio e fissaggio
- Tagliare la punta di una punta per pipetta P20 o P100 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura della punta a ~1 mm di raggio e lubrificare pipettando una miscela di PBS e grasso su e giù. Questo grasso può essere ottenuto dai resti della carcassa rimossi al punto 2.6.
- Trasferire i complessi occhio-cervello in ~400 μL di PBS in un piatto di vetro a 9 pozzetti, su ghiaccio. Utilizzare il puntale lubrificato e una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100 per il trasferimento.
NOTA: I complessi occhio-cervello aderiscono ai puntali non lubrificati durante il pipettaggio e vengono danneggiati o persi.
- Rimuovere il grasso rimanente associato al tessuto oculare pipettando il PBS su e giù per far roteare delicatamente i complessi occhio-cervello. In questa e in tutte le successive fasi di lavaggio, non pipettare direttamente i complessi occhio-cervello su e giù poiché ciò danneggerebbe il fragile tessuto oculare.
- Trasferire i complessi occhio-cervello in un volume minimo (<20 μL) di PBS in almeno 250 μL di fissativo. Mescolare pipettando la soluzione su e giù. Incubare per 35 minuti, su ghiaccio.
NOTA: Per questo trasferimento può essere utilizzata la stessa punta lubrificata preparata al punto 3.1.1.
- Con lo stesso puntale della pipetta, trasferire i complessi occhio-cervello in un pozzetto contenente ~400 μL di PBS. Mescolare pipettando la soluzione su e giù e incubare per 5-10 minuti con ghiaccio, per lavare. Ripetere la fase di lavaggio almeno due volte.
NOTA: I complessi occhio-cervello possono essere mantenuti per diverse ore nel lavaggio finale del PBS, su ghiaccio o a 4 °C, prima di procedere al passaggio 3.3.1.
- Colorazione degli anticorpi
- Per bloccare il tessuto prima dell'esposizione alle soluzioni anticorpali, trasferire i complessi occhio-cervello a ~400 μL di PBT. Per il trasferimento utilizzare il puntale lubrificato e una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100. Incubare per 10-60 minuti, con ghiaccio.
- Preparare la soluzione di anticorpi primari diluendo gli anticorpi appropriati in PBT. Poiché i complessi occhio-cervello sono incubati in aliquote da 10 μL di soluzione anticorpale, il volume preparato sarà una replica di 10.
- Aliquotare 10 μl di soluzione di anticorpi in un pozzetto pulito di un vassoio per micropozzetti da 72 pozzetti.
- Tagliare la punta di una punta per pipetta P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura del puntale a ~0,5 mm di raggio e lubrificare pipettando il PBT su e giù.
- Trasferire non più di 5 complessi occhio-cervello, in un volume di <3 μL di PBS, in ciascun pozzetto da 10 μL di soluzione anticorpale utilizzando una micropipetta a spostamento d'aria P10 e il puntale lubrificato.
- Omogeneizzare la soluzione anticorpale pipettandola su e giù. Non pipettare i complessi occhio-cervello su e giù poiché ciò danneggerebbe il tessuto.
- Per ridurre al minimo l'evaporazione della soluzione anticorpale, posizionare un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata nel vassoio del micropozzetto e sigillare il vassoio (ad esempio, con il coperchio in dotazione). Incubare per una notte a 4 °C.
- Trasferire i complessi occhio-cervello dal vassoio del micropozzetto in ~400 μL di PBT in un piatto di vetro a 9 pozzetti, per lavarli. Utilizzare una micropipetta a spostamento d'aria P10 e un puntale lubrificato con PBT (preparare come descritto al punto 3.3.4). Mescolare pipettando la soluzione su e giù. Incubare per 5-10 minuti con ghiaccio.
- Ripetere la fase di lavaggio almeno due volte. Utilizzare una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100 e una punta lubrificata con PBT per trasferire i complessi occhio-cervello tra le soluzioni di lavaggio.
- Preparare la soluzione di anticorpi secondari diluendo gli anticorpi secondari appropriati marcati con fluorofori in PBT secondo necessità. 100 μL di soluzione di anticorpi secondari sono sufficienti per lotto di 6-10 pupe. Aliquotare la soluzione di anticorpi secondari in una capsula di dissezione in vetro a 9 pozzetti.
- Trasferire i complessi occhio-cervello in una soluzione anticorpale secondaria. Per il trasferimento utilizzare una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100 e un puntale lubrificato in PBT.
- Incubare i complessi occhio-cervello in una soluzione di anticorpi secondari per 1-2 ore a temperatura ambiente o 3-5 ore a 4 °C. Per evitare lo sbiancamento dei fluorofori con la luce, coprire la preparazione con un foglio.
NOTA: La durata ottimale dell'incubazione nella soluzione di anticorpi secondari può variare a seconda degli anticorpi primari e secondari utilizzati.
- Trasferire i complessi occhio-cervello in ~400 μL di PBT in un piatto di vetro a 9 pozzetti, per lavarli. Mescolare pipettando la soluzione su e giù. Incubare per 5-10 minuti con ghiaccio. Questa fase di lavaggio deve essere ripetuta almeno due volte.
- Fissazione secondaria
- Per una fissazione secondaria, trasferire i complessi occhio-cervello ad almeno 200 μL di fissativo e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente o 35 minuti a 4 °C.
NOTA: La fissazione secondaria irrigidisce il tessuto oculare, facilitando il montaggio (passaggio 3.5).
- Utilizzare una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100 e una punta lubrificata con PBT per trasferire i complessi occhio-cervello in ~400 μL di PBT in un piatto di vetro a 9 pozzetti, su ghiaccio, per lavare per 5 minuti.
- Ripetere la fase di lavaggio almeno una volta.
- Utilizzare una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100 e una punta lubrificata con PBT per trasferire i complessi occhio-cervello in ~400 μL di PBS in una capsula di vetro a 9 pozzetti, su ghiaccio, da risciacquare per 1-2 minuti. Mantenere il tessuto in movimento pipettando la PBS, ma non il tessuto, su e giù per evitare che i complessi occhio-cervello si depositino e aderiscano alla piastra di vetro durante il risciacquo PBS.
- montante
- Trasferire i complessi occhio-cervello in ~200 μL di terreno di montaggio. Utilizzare una micropipetta a spostamento d'aria P20 o P100 e una punta lubrificata con PBT per trasferire i complessi occhio-cervello. Lasciare che il tessuto si equilibri nel mezzo di montaggio per 1-2 ore.
- Posizionare una goccia da 5-8 μl di terreno di montaggio fresco su un vetrino da microscopio pulito.
- Tagliare una punta P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura della punta a ~0,5 mm di raggio e utilizzare questa e una micropipetta a spostamento d'aria P10 per trasferire i complessi occhio-cervello in 5-8 μL di terreno di montaggio nella goccia di terreno di montaggio sul vetrino.
- Utilizzare due aghi di tungsteno per separare gli occhi dai lobi ottici. Appuntare un complesso occhio-cervello sul vetrino con un robusto ago di tungsteno e tagliare ciascun occhio dal lobo ottico associato con un ago di tungsteno sottile (Figura 2F).
- Utilizzare l'ago di tungsteno sottile per manovrare ciascun occhio sulla superficie del vetrino del microscopio con la superficie basale di ciascun occhio adiacente al vetrino. Abbassare delicatamente un vetrino coprioggetti pulito sul fazzoletto e fissarlo con lo smalto.
NOTA: Disporre gli occhi sul vetrino in modo che siano vicini l'uno all'altro o in linea faciliterà la microscopia successiva.
- Imaging delle retine mediante microscopia fluorescente o confocale.
NOTA: I vetrini devono essere conservati a 4 °C se non vengono riprodotti immediatamente.
