drosofila Dissezione del muscolo del volo indiretto (IFM) della pupa tardiva: un metodo per la raccolta di tessuti ad alto rendimento

Abstract

Fonte: Kao, S. Y., et al. Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per approcci omici. J. Vis. Exp. (2019).

I muscoli di volo della Drosophila sono utilizzati come sistema modello per lo sviluppo muscolare e la fisiologia. Questo video descrive la muscolatura di volo degli adulti e mette in evidenza un protocollo per sezionare lo sviluppo di muscoli di volo indiretti adatti al sequenziamento dell'RNA dalle pupe.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Dissezione IFM dopo 48 h APF

1. Assemblare l'attrezzatura necessaria, tra cui due pinze per biologia #5, forbici fini, vetrini per microscopio in vetro standard, nastro biadesivo, pipetta, puntali per pipette, ghiaccio secco e (per applicazioni RNA) reagente di isolamento (vedi Tabella dei materiali). Raffreddare 1x PBS e le provette per microcentrifuga con ghiaccio.
2. Usando un pennello leggermente bagnato, trasferisci le pupe in scena ....

Risultati

Figura 1: Dissezione di IFM dopo 48 ore di APF. (A) Allineamento delle pupe su nastro biadesivo. (B) Rimozione delle pupe dalla custodia della pupa mediante apertura anteriore, taglio dorsale della custodia (B') e sollevamento della pupa (B''). I simboli del cerchio sono rappresentati allo stesso modo della Figura 2. (C).......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di coltura da 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Piastre Greiner, 60 mm x 15 mM, ventilate
Fotocamera del cellulare, Samsung Galaxy S9	S.r.	SM-G960F/DS	utilizzato per foto non scattate al microscopio
Nastro biadesivo	Scozzese/3M	3M ID 70005108587	Nastro biadesivo, disponibile presso la maggior parte dei gestori di forniture per ufficio
Pinze Dumont #5	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20	Pinza in acciaio inox punta dritta da 11 cm, grado Biologia con punta da 0,05 mm x 0,02 mm
fotocamera per microscopio da dissezione fluorescente, fotocamera Leica DFC310 FX	Leica		www.leica-microsystems.com
Software per microscopio da dissezione a fluorescenza, Leica Application Suite (LAS) versione 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Microscopio da dissezione a fluorescenza, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Volare: Bru1[M2]			Mosca stock; Questo documento
Volare: Bru1[M3]			Mosca stock; Questo documento
Volare: Mef2-GAL4	Centro azionario di Bloomington	BDSC:27390	Azioni volanti
Volare: salm[1]	Centro azionario di Bloomington	Telefono 3274	Azioni volanti
Volare: salm[FRT]			Stock di mosche; vedi Spletter et al., Elife, 2018
Volare: UAS-Bru1IR	Centro di ricerca sulla Drosophila di Vienna	GD41568	Fly stock, forcina RNAi
Volare: UAS-GFP::Gma	Centro azionario di Bloomington	BDSC:31776	Azioni volanti
Volare: UAS-mCD8a::GFP	Centro azionario di Bloomington	BDSC:5130	Azioni volanti
Volare: w[1118]	Centro azionario di Bloomington	3605	Azioni volanti
Volare: weeP26			Mosca; vedi Clyne et al., Genetics, 2003
Reagente per rivelazione GFP, GFP-Booster	CromoTek	GBA488-100
glicogeno	Invitrogen	Codice 10814-010
Software di elaborazione delle immagini, Photoshop CS6	adobe		www.adobe.com
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanolo
Metodo 1 (isolamento dell'RNA): TRIzol	Tecnologie per la vita	15596018	Soluzione monofasica di isotiocianato di guanidinio e fenolo
Metodo 2 (isolamento dell'RNA): Metodo 1 + Kit TURBO DNA-free	Invitrogen	AM1907	Isolamento del TRIzol seguito da trattamento con un kit per la rimozione del DNA
Metodo 3 (isolamento dell'RNA): kit Direct-zol RNA Miniprep Plus	Ricerca Zymo	R2070S	Isolamento dell'RNA in TRIzol, ma su colonne commerciali invece di utilizzare la separazione di fase. Trattamento DNasi raccomandato eseguito con Monarch Dnase I nel tampone di reazione Monarch DNasi I.
Metodo 4 (isolamento dell'RNA): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	Codice: 74134	Abbiamo utilizzato il trattamento DNasi fornito. I pellet IFM sono stati omogeneizzati in tampone RTL come suggerito per i tessuti animali.
Metodo 5 (isolamento dell'RNA): sistema di miniprep tissutale a RNA ReliaPrep	Promega	Z6110	Abbiamo applicato il protocollo per la "Purificazione dell'RNA da tessuti fibrosi".
Metodo 6 (isolamento dell'RNA): kit di minipreparazione dell'RNA totale Monarch	Biolaboratori del New England	T2010G	Abbiamo applicato il protocollo per tessuti/leucociti e analizzato 300 μL di reagente di protezione dell'RNA.
Provette per microcentrifuga	Thermo Fisher	AM12400	Provette per microfuge senza RNasi, 1,5 mL
Vetrini per microscopio	Thermo Fisher	12342108	Slitte standard, non caricate, 1 mm
pennello	Marabu	Codice 19100000000	Marabu Fino Round No. 0, o pennello simile da qualsiasi materiale artistico
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Tampone PBS (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Compresse saline tamponate con fosfato per soluzioni da 1 L, pH 7,4
Puntali per pipette PFA PureTip	Elementare Scientifico	ES-7000-0101	Sostituto opzionale dei puntali per pipette standard per ridurre la perdita di campione; 100 mL, orifizio da 0,8 mm
Puntali per pipette	Sigma-Aldrich	P5161	Puntali per pipette universali da 200 mL
Concentrazione di RNA Approccio 1 e tracce di integrità dell'RNA, Bioanalizzatore	Tecnologie Agilent	G2939BA
Concentrazione di RNA Approccio 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
Concentrazione di RNA Approccio 3, Qubit 4 Fluorimetro	Invitrogen	Domanda 33238
RNasi A	Promega	Codice: A7937
Acqua priva di RNasi, Dietil pirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Il DEPC tratta l'acqua durante la notte e poi l'autoclave, per rimuovere tutta la RNasi.
Kit RT #1: Kit per trascrittasi inversa Super Script III	Invitrogen	Codice 18080-044	Kit per trascrizione inversa
Kit RT #2: LunaScript	Biolaboratori del New England	E3010S	Kit per trascrizione inversa
Kit RT #3: Kit di trascrizione inversa QuantiNova	Qiagen	Codice 205410	Kit per trascrizione inversa
Software statistico: GraphPad Prism	Prisma GraphPad		www.graphpad.com
Software statistico: Microscoft Excel	Valentina		Acquistato come parte del pacchetto: Office Home & Student 2019
Centrifuga da tavolo	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 o equivalente
Fazzoletti/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Salviette fazzoletti standard
Pipetta di trasferimento	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipetta in plastica
Forbici a molla Vannas	Strumenti per la scienza	Codice 15000-00	Tagliente da 3 mm, diametro della punta 0,05 mm, lunghezza 8 cm
Carta Whatman	Sigma-Aldrich	Codice 1004-070	Cerchi di carta da filtro, Grado 4, 70 mm