drosofila Dissezione del muscolo del volo indiretto (IFM) della pupa tardiva: un metodo per la raccolta di tessuti ad alto rendimento

Abstract

Fonte: Kao, S. Y., et al. Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per approcci omici. J. Vis. Exp. (2019).

I muscoli di volo della Drosophila sono utilizzati come sistema modello per lo sviluppo muscolare e la fisiologia. Questo video descrive la muscolatura di volo degli adulti e mette in evidenza un protocollo per sezionare lo sviluppo di muscoli di volo indiretti adatti al sequenziamento dell'RNA dalle pupe.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Dissezione IFM dopo 48 h APF

1. Assemblare l'attrezzatura necessaria, tra cui due pinze per biologia #5, forbici fini, vetrini per microscopio in vetro standard, nastro biadesivo, pipetta, puntali per pipette, ghiaccio secco e (per applicazioni RNA) reagente di isolamento (vedi Tabella dei materiali). Raffreddare 1x PBS e le provette per microcentrifuga con ghiaccio.
2. Usando un pennello leggermente bagnato, trasferisci le pupe in scena su una striscia di nastro biadesivo montata su un vetrino da microscopio (Figura 1A). Posizionare le pupe in una linea, orientate con lo stesso orientamento (ventrale verso il basso e anteriormente verso il fondo del vetrino).
   NOTA: Fai attenzione a non usare troppa acqua sul pennello o sul filtro, altrimenti le pupe non si attaccheranno bene. Se le pupe non si attaccano, asciugatele trasferendole prima su un filtro asciutto o su carta velina. Monta il maggior numero di pupe che possono essere sezionate entro una finestra temporale di 30 minuti, idealmente ~10 pupe.
3. Rimuovere la pupa dalla custodia pupale. Usa il forcipe per staccare e aprire la custodia pupale sopra gli spiracoli anteriori (Figura 1B).
4. Far scorrere delicatamente un paio di pinze dorsalmente verso la parte posteriore, tagliando la custodia pupale mentre le pinze si muovono (Figura 1B'). Fare attenzione a non rompere la pupa sottostante. Liberare la pupa dalla custodia aperta e trasferirla immediatamente in una goccia di 1x PBS su un secondo vetrino da microscopio (Figura 1B",C).
5. Ripeti i passaggi 1.3 e 1.4 per tutte le pupe della linea, quindi metti da parte il vetrino del nastro biadesivo.
6. Usando le forbici sottili, taglia l'addome della pupa lontano dal torace e spingilo in un mucchio separato (Figure 1D,D'). Ripetere per le pupe rimanenti.
   NOTA: Iniziare a cronometrare la durata della dissezione con il passaggio 1.6, non appena l'integrità della pupa viene interrotta. Sezionare il maggior numero possibile di mosche in 20-30 minuti per prevenire la morte cellulare e i cambiamenti trascrittomici e proteomici associati. Quando si sezionano adulti 1 d o pupe di >90 ore, è spesso conveniente per i passaggi successivi rimuovere ulteriormente la testa con le forbici sottili.
7. Usando un fazzoletto di carta, rimuovere la maggior parte del PBS 1x (generalmente torbido con grasso sospeso) e la pila di addomi (Figura 1E). Aggiungi una goccia di 1x PBS fresco e freddo al torace rimanente.
8. Usa le forbici per tagliare il torace a metà (Figura 1F,F') tagliando dalla testa lungo l'asse longitudinale del corpo con un unico movimento. In alternativa, se la testa è stata rimossa, inserire prima le forbici dove era attaccata la testa e tagliare la metà superiore del torace longitudinalmente tra gli IFM. Quindi, tagliare il lato ventrale del torace con un secondo taglio dello stesso orientamento.
9. Ripetere i passaggi 1.7 e 1.8 per tutte le pupe da sezionare, generando un mucchio di emisezioni del torace vicino al centro del vetrino. Assicurarsi che ci sia abbastanza 1x PBS raffreddato sul vetrino in modo che le emisezioni non si secchino.
   NOTA: Dopo 48 ore di APF, gli IFM sono abbastanza grandi da essere visibili all'occhio allenato con un microscopio da dissezione standard. A questo punto del protocollo, i muscoli con un'etichetta fluorescente possono essere spostati in un endoscopio da dissezione fluorescente per facilitare l'identificazione dell'IFM o per scopi di allenamento, ma questo non è necessario.
10. Seziona gli IFM dal torace. Isolare una delle emisezioni usando la pinza #5 (Figura 1G,H). Inserire delicatamente le punte di una pinza sopra e sotto il centro degli IFM (Figura 1G',H'). Tenendo ferma la prima pinza, usa le forbici sottili per tagliare un'estremità dell'IFM lontano dalla cuticola e dai tendini. Quindi, tagliare l'altra estremità dell'IFM liberandola dalla cuticola (Figure 1G'',H'').
    NOTA: A seconda dell'orientamento del torace dopo il primo taglio IFM, è utile ruotare il torace di 180° in modo che il secondo taglio IFM sia più facile da eseguire.
11. Rimuovere il fascio IFM dal torace con una pinza (Figura 1G''',H'''), trasferendolo sul bordo della bolla PBS per utilizzare la tensione dell'acqua per tenerlo in posizione (Figura 1I). Spingere la carcassa sul lato opposto del carrello. Ripetere l'operazione per le emisezioni del torace rimanenti, generando una raccolta di IFM sezionati.
    NOTA: Se gli IFM non rimangono in una pila ordinata, rimuovi un po' di PBS 1x con un fazzoletto. Fare attenzione a non far evaporare tutto il PBS e assicurarsi che gli IFM e gli emitorassi sezionati rimangano coperti da un tampone.
12. Dopo aver sezionato tutti gli IFM, eseguire rapidamente un controllo di qualità sul muscolo sezionato. Utilizzando la pinza #5, rimuovere eventuali frammenti di muscolo saltatore o cuticola che potrebbero aver trovato la loro strada nel campione (Figure 1J-K'').
    NOTA: Il muscolo del salto appare diverso dall'IFM. Se si seziona un muscolo marcato con Mef2-Gal4 sotto fluorescenza, il muscolo del salto ha una fluorescenza più debole e una forma e consistenza diverse. Alla luce normale, appare quasi traslucido mentre gli IFM sono di un giallo opaco e lattiginoso (Figura 1J-J'',K).
13. Usando la tensione dell'acqua, cattura (ma non schiaccia) gli IFM sezionati tra un paio di pinze (Figura 1L). Trasferire gli IFM in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL pre-riempita con 250 μL di 1x PBS refrigerato (Figura 1M). Procedere immediatamente con la sezione 2.
    NOTA: Quando le punte delle pinze vengono avvicinate l'una all'altra e sollevate da una soluzione tampone, la tensione dell'acqua provoca l'intrappolamento di una bolla di tampone tra le punte delle pinze. Se in questa bolla sono presenti anche IFM, possono essere sollevati dalla soluzione e facilmente trasferiti in un altro recipiente riempito di tampone. È importante stringere le pinze per avvicinare le punte senza toccarsi, per evitare di macerare il tessuto catturato nella bolla tampone.

2. Pellet e Conserva il Campione IFM

1. Pellettare gli IFM centrifugando la provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per 3-5 minuti a 2.000 x g in una centrifuga da tavolo (Figura 2A,B).
2. Rimuovere il tampone utilizzando una punta per pipetta (Figura 2C).
3. Per le applicazioni con l'RNA, risospendere il pellet IFM in 50-100 μL del tampone di isolamento dell'RNA desiderato (vedere la Tabella dei materiali, Figura 2D). In caso contrario, procedere al passaggio 2.4.
   NOTA: Gli IFM possono essere congelati a secco dopo la fase 2.2 per preparazioni di spettrometria di massa o isolamento di RNA con kit commerciali (vedere risultati rappresentativi). Per le applicazioni a RNA, si ottengono risultati migliori risospendendo e congelando immediatamente il pellet IFM in tampone di isolamento.
4. Congelare il campione su ghiaccio secco o congelare a scatto in azoto liquido (Figura 2E). Conservare a -80 °C fino al momento di prepararsi per le fasi successive della preparazione del campione per l'analisi a valle.
   NOTA: Dopo la crioconservazione, i campioni possono essere conservati per diversi mesi prima di essere elaborati per l'indagine a valle.

Risultati

Figura 1: Dissezione di IFM dopo 48 ore di APF. (A) Allineamento delle pupe su nastro biadesivo. (B) Rimozione delle pupe dalla custodia della pupa mediante apertura anteriore, taglio dorsale della custodia (B') e sollevamento della pupa (B''). I simboli del cerchio sono rappresentati allo stesso modo della Figura 2. (C)...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di coltura da 60 mm	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Piastre Greiner, 60 mm x 15 mM, ventilate
Fotocamera del cellulare, Samsung Galaxy S9	S.r.	SM-G960F/DS	utilizzato per foto non scattate al microscopio
Nastro biadesivo	Scozzese/3M	3M ID 70005108587	Nastro biadesivo, disponibile presso la maggior parte dei gestori di forniture per ufficio
Pinze Dumont #5	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20	Pinza in acciaio inox punta dritta da 11 cm, grado Biologia con punta da 0,05 mm x 0,02 mm
fotocamera per microscopio da dissezione fluorescente, fotocamera Leica DFC310 FX	Leica		www.leica-microsystems.com
Software per microscopio da dissezione a fluorescenza, Leica Application Suite (LAS) versione 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Microscopio da dissezione a fluorescenza, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Volare: Bru1[M2]			Mosca stock; Questo documento
Volare: Bru1[M3]			Mosca stock; Questo documento
Volare: Mef2-GAL4	Centro azionario di Bloomington	BDSC:27390	Azioni volanti
Volare: salm[1]	Centro azionario di Bloomington	Telefono 3274	Azioni volanti
Volare: salm[FRT]			Stock di mosche; vedi Spletter et al., Elife, 2018
Volare: UAS-Bru1IR	Centro di ricerca sulla Drosophila di Vienna	GD41568	Fly stock, forcina RNAi
Volare: UAS-GFP::Gma	Centro azionario di Bloomington	BDSC:31776	Azioni volanti
Volare: UAS-mCD8a::GFP	Centro azionario di Bloomington	BDSC:5130	Azioni volanti
Volare: w[1118]	Centro azionario di Bloomington	3605	Azioni volanti
Volare: weeP26			Mosca; vedi Clyne et al., Genetics, 2003
Reagente per rivelazione GFP, GFP-Booster	CromoTek	GBA488-100
glicogeno	Invitrogen	Codice 10814-010
Software di elaborazione delle immagini, Photoshop CS6	adobe		www.adobe.com
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanolo
Metodo 1 (isolamento dell'RNA): TRIzol	Tecnologie per la vita	15596018	Soluzione monofasica di isotiocianato di guanidinio e fenolo
Metodo 2 (isolamento dell'RNA): Metodo 1 + Kit TURBO DNA-free	Invitrogen	AM1907	Isolamento del TRIzol seguito da trattamento con un kit per la rimozione del DNA
Metodo 3 (isolamento dell'RNA): kit Direct-zol RNA Miniprep Plus	Ricerca Zymo	R2070S	Isolamento dell'RNA in TRIzol, ma su colonne commerciali invece di utilizzare la separazione di fase. Trattamento DNasi raccomandato eseguito con Monarch Dnase I nel tampone di reazione Monarch DNasi I.
Metodo 4 (isolamento dell'RNA): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	Codice: 74134	Abbiamo utilizzato il trattamento DNasi fornito. I pellet IFM sono stati omogeneizzati in tampone RTL come suggerito per i tessuti animali.
Metodo 5 (isolamento dell'RNA): sistema di miniprep tissutale a RNA ReliaPrep	Promega	Z6110	Abbiamo applicato il protocollo per la "Purificazione dell'RNA da tessuti fibrosi".
Metodo 6 (isolamento dell'RNA): kit di minipreparazione dell'RNA totale Monarch	Biolaboratori del New England	T2010G	Abbiamo applicato il protocollo per tessuti/leucociti e analizzato 300 μL di reagente di protezione dell'RNA.
Provette per microcentrifuga	Thermo Fisher	AM12400	Provette per microfuge senza RNasi, 1,5 mL
Vetrini per microscopio	Thermo Fisher	12342108	Slitte standard, non caricate, 1 mm
pennello	Marabu	Codice 19100000000	Marabu Fino Round No. 0, o pennello simile da qualsiasi materiale artistico
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Tampone PBS (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Compresse saline tamponate con fosfato per soluzioni da 1 L, pH 7,4
Puntali per pipette PFA PureTip	Elementare Scientifico	ES-7000-0101	Sostituto opzionale dei puntali per pipette standard per ridurre la perdita di campione; 100 mL, orifizio da 0,8 mm
Puntali per pipette	Sigma-Aldrich	P5161	Puntali per pipette universali da 200 mL
Concentrazione di RNA Approccio 1 e tracce di integrità dell'RNA, Bioanalizzatore	Tecnologie Agilent	G2939BA
Concentrazione di RNA Approccio 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
Concentrazione di RNA Approccio 3, Qubit 4 Fluorimetro	Invitrogen	Domanda 33238
RNasi A	Promega	Codice: A7937
Acqua priva di RNasi, Dietil pirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Il DEPC tratta l'acqua durante la notte e poi l'autoclave, per rimuovere tutta la RNasi.
Kit RT #1: Kit per trascrittasi inversa Super Script III	Invitrogen	Codice 18080-044	Kit per trascrizione inversa
Kit RT #2: LunaScript	Biolaboratori del New England	E3010S	Kit per trascrizione inversa
Kit RT #3: Kit di trascrizione inversa QuantiNova	Qiagen	Codice 205410	Kit per trascrizione inversa
Software statistico: GraphPad Prism	Prisma GraphPad		www.graphpad.com
Software statistico: Microscoft Excel	Valentina		Acquistato come parte del pacchetto: Office Home & Student 2019
Centrifuga da tavolo	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 o equivalente
Fazzoletti/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Salviette fazzoletti standard
Pipetta di trasferimento	Sigma-Aldrich	Z350796	Pipetta in plastica
Forbici a molla Vannas	Strumenti per la scienza	Codice 15000-00	Tagliente da 3 mm, diametro della punta 0,05 mm, lunghezza 8 cm
Carta Whatman	Sigma-Aldrich	Codice 1004-070	Cerchi di carta da filtro, Grado 4, 70 mm