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Questo protocollo è un estratto da Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis.(2019).
1. Imaging del calcio in vivo
- Utilizzare un microscopio multifotone dotato di un laser a infrarossi e di un obiettivo a immersione in acqua (vedi Tabella dei materiali), installato su un tavolo isolato dalle vibrazioni. Per la visualizzazione di indicatori di calcio basati su GFP, sintonizzare il laser su una lunghezza d'onda di eccitazione di 920 nm e installare un filtro passa-banda GFP.
- Utilizzando la manopola di regolazione Z grossolana, eseguire la scansione attraverso l'asse Z del cervello e individuare la regione cerebrale di interesse. Utilizzare la funzione di ritaglio per concentrare la scansione solo su quest'area per ridurre al minimo il tempo di scansione e per ruotare la vista di scansione in modo che la parte anteriore della testa sia rivolta verso il basso.
- Regola le dimensioni del fotogramma a 512 x 512 px, la velocità di scansione a > 4 Hz e la scansione della regione (nella dimensione Y) in modo da coprire i neuroni di interesse.
2. Visualizzazione dei transitori di calcio evocati dagli odori attraverso il condizionamento olfattivo
- Utilizza un sistema di erogazione degli odori in grado di fornire diversi stimoli olfattivi in modo temporalmente preciso.
- Utilizzare un computer aggiuntivo per controllare il dispositivo e per comunicare con il software del microscopio di imaging per coordinare le stimolazioni degli odori con l'acquisizione delle immagini durante gli esperimenti.
- Avviare un pacchetto macro pre-programmato in grado di collegare il software di acquisizione delle immagini e il programma di erogazione degli odori (ad esempio, un pacchetto macro VBA installato nel software di controllo del microscopio, vedere Tabella dei materiali) che risponde a un trigger di input esterno fornito dall'avvio di un protocollo di erogazione degli odori in un programma separato).
- Avvia la misurazione monitorando i transitori di calcio evocati dagli odori "pre-allenamento"/naive a una risoluzione di 512 x 512 px e un frame rate di 4 Hz. Fornisci uno stimolo olfattivo di 2,5 s affiancato da un'acquisizione di immagini aggiuntiva per 6,25 s prima dell'insorgenza dell'odore (per stabilire un valore basale F0) e 12,5 s dopo l'offset dell'odore. Ripeti l'operazione con un secondo odorante e poi con un terzo odorante.
- Continuare 3 minuti dopo questa misurazione con il condizionamento classico ("allenamento") della mosca.
- Seleziona uno degli odori presentati nella fase di "pre-allenamento" per diventare l'odore CS+ e un altro per diventare l'odore CS-. Presenta l'odore CS+ utilizzando il sistema di erogazione degli odori controllato da computer per 60 s insieme a dodici scosse elettriche da 90 V.
- Dopo una pausa di 60 s, presentare l'odore CS- da solo per 60 s. Utilizzare come odoranti 4-metilcicloesanolo e 3-ottanolo. Non presentare il terzo odorante (ad es. 1-octen-3-olo) durante questo allenamento poiché viene utilizzato come controllo solo prima (passaggio 2.2.) e dopo (passaggio 2.4) la fase di allenamento.
- Misurare nuovamente i transitori di calcio evocati dagli odori "post-allenamento" ripetendo il protocollo di stimolazione degli odori "pre-allenamento" (passaggio 2.2.) 3 minuti dopo aver terminato la fase di allenamento (passaggio 2.3).
NOTA: La tempistica di questo passaggio dovrebbe riflettere il tempo di interesse dopo la formazione della memoria (ad esempio, eseguire questo passaggio 3-4 minuti dopo la fase di condizionamento per indagare la memoria a breve termine). In genere, le mosche possono sopravvivere per diverse ore in questa preparazione.
- Salvare i file di imaging in un formato appropriato (ad es. Tiff) per una successiva analisi dell'immagine.