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Questo protocollo è un estratto da Gervaise e Arur, Analisi spaziale e temporale di ERK attivo nella linea germinale di C. elegans. J. Vis. Exp.(2016).
1. Dissezione di vermi adulti per ottenere gonadi
- Scegliere 100 - 150 WT (N2) o il genotipo desiderato di vermi allo stadio di sviluppo desiderato e specifico (L1, L2, L3, L4, adulto, ecc.) in 100 μl di tampone M9 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Riempire la provetta da microcentrifuga con 900 μl di tampone M9 (vedere la tabella dei materiali). Centrifugare le provette a 1.000 x g in una microcentrifuga per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Rimuovere delicatamente 900 μl del tampone M9 e gettarlo. Rimuovere il tampone sotto un microscopio da dissezione per assicurarsi che i vermi non vengano rimossi accidentalmente.
- Ripetere i passaggi 1.2 - 1.3 altre due volte con un tampone M9 nuovo ogni volta. Ciò garantisce che tutti i batteri che sono stati trasportati con i vermi vengano efficacemente lavati via.
- Dopo il lavaggio finale, rimuovere 900 μl di tampone M9 dalla provetta e gettare via.
- Trasferire i restanti 100 μl di tampone M9 contenente i vermi da 100 a 150 con una punta per micropipetta da 200 μl in un piatto di vetro a fondo piatto. Assicurarsi che il puntale della micropipetta sia tagliato alla tacca di 10 μl prima dell'uso. Non tagliare la punta provocherà il taglio dei vermi.
- Aggiungere 1 - 3 μl di levamisolo 0,1 M al piatto di vetro dell'orologio contenente i vermi nel tampone M9. Agitare delicatamente il levamisolo e l'M9 per consentire una miscelazione uniforme fino a quando i vermi smettono di muoversi.
NOTA: Le scorte di levamisolo possono essere conservate a -20 °C per la conservazione a lungo termine. In questo caso, utilizzare la concentrazione più alta di 1 - 3 mM rispetto a quanto descritto in letteratura23 di 0,2 - 0,25 mM di levamisolo per ottenere una rapida perdita di mobilità negli animali. Se gli animali si aggirano troppo a lungo nella sospensione liquida, i modelli risultanti di dpERK nelle gonadi possono essere variabili (a causa dello stress o della mancanza di nutrimento o di entrambi). Modelli di colorazione più riproducibili sono stati ottenuti con 1 - 3 mM di levamisolo per la dissezione.
- Collegare due aghi da 25 G a due siringhe da 1 ml (la dimensione della siringa non ha importanza, il calibro dell'ago è critico). Posizionare una siringa in ciascuna mano (Figura 1).
- Sotto un microscopio da dissezione, posizionare ogni ago sotto e sopra ogni verme come mostrato nella Figura 1 e posizionare un taglio sottile sul verme vicino al secondo bulbo faringeo con un movimento simile a una forbice. Dopo un taglio nel verme, passa all'animale successivo fino a quando tutti gli animali nel piatto sono stati tagliati almeno una volta.
NOTA: Tieni presente che i passaggi 1.8 - 1.9 sono sensibili al tempo. Sezionare tutti i vermi nella piastra in meno di cinque minuti per ottenere un modello dpERK riproducibile. Tempi di dissezione più lunghi comporteranno la disattivazione del segnale dpERK, specialmente nella Zona 1. Se necessario, regolare il numero di vermi per ciclo di dissezione (ad esempio, 50 vermi contro 150) per rimanere nel periodo di tempo assegnato.
- Nel caso in cui una gonade estrusa non sia visibile durante la dissezione, non tentare un altro taglio nello stesso animale. Di solito questo toserà solo l'animale e non provocherà l'estrusione della gonade. Invece, passa all'animale successivo. I vermi in cui le gonadi non estrudono appariranno come tali sui vetrini che verranno realizzati nella sezione 6 e possono essere ignorati durante l'imaging
NOTA: Durante tutte le fasi di dissezione e lavorazione, è importante tenere presente che la gonade rimarrà attaccata al corpo/carcassa. Non forzare la gonade e il corpo con l'ago. Spesso una lacerazione aberrante nel tessuto gonadico, nel tentativo di recidere la gonade dal corpo, può provocare un segnale anticorpale spurio. Il corpo/carcassa può essere ignorato durante le fasi di imaging e solo la gonade può essere visualizzata. Inoltre, a volte le cellule intestinali possono anche fungere da controlli interni/controlli somatici per l'anticorpo da analizzare.
Figura 1: Dimostrazione delle posizioni dell'ago durante le dissezioni. A sinistra: Fotografia di una dissezione in corso. A destra: Posizioni dell'ago con riferimento alla vite senza fine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
