Il seguente protocollo è un estratto da Prior et al, <a href="https://www.jove.com/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins</a>, J. Vis. Exp. (2018).
PCR e genotipizzazione a verme singolo
<ol>
	<li>Dopo 1 - 2 giorni di deposizione delle uova, trasferire gli F1in singoli tappi di provette per PCR contenenti 7 μL di tampone per lisi dei vermi utilizzando un plettro (Tabella 1, Figura 1D, giorni 4 - 5).</li>
	<li>Centrifugare le provette per PCR alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per portare gli animali sul fondo della provetta e congelare le provette a -80 °C per 1 h. 
	NOTA: I vermi possono essere conservati a -80 °C a tempo indeterminato.</li>
	<li>Lizzare i vermi congelati in un termociclatore utilizzando il seguente programma: 60 °C per 60 min, 95 °C per 15 min, 4 °C hold.</li>
	<li>Impostare la mastermix PCR come mostrato nella Tabella 2.</li>
	<li>Aggiungere 21 μl di mastermix per PCR in provette per PCR pulite, quindi aggiungere 4 μl di lisi a vite senza fine dalla fase 3. Mescolare bene utilizzando una pipetta ed eseguire il programma PCR seguendo le linee guida del produttore (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Purificare le reazioni PCR utilizzando un kit DNA Clean and Concentrate, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Eluire il DNA aggiungendo 10 μL di acqua alla colonna di centrifuga.</li>
	<li>Mastermix enzimatico di restrizione all'impostazione come mostrato nella Tabella 3.</li>
	<li>Aggiungere 10 μl di mastermix dell'enzima di restrizione a ciascuna reazione PCR pulita e incubare per 1 - 2 ore a 37 °C.</li>
	<li>I prodotti PCR digeriti separati su un gel di agarosio all'1,5% vengono eseguiti a 120 V utilizzando 1 tampone Tris-acetato-EDTA (TAE).</li>
</ol>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:839px;" width="839">
	<tbody>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="altezza:20px;larghezza:247px;">Acqua priva di nucleasi</td>
			<td style="width:180px;">Synthego Inc.</td>
			<td style="width:206px;">fornito con il kit sgRNA EZ kit</td>
			<td style="larghezza:207px;"></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DNA Clean & Concentrator</td>
			<td>Ricerca Zymo</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Kit di recupero del DNA in gel Zymoclean</td>
			<td>Ricerca Zymo</td>
			<td>D4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Q5 Hot Start Mix Master 2X ad Alta Fedeltà</td>
			<td>Biolaboratori del New England</td>
			<td>Codice: M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Proteinasi K</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Codice: M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NP-40</td>
			<td>sigma</td>
			<td>Codice: 74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientifico</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr altezza="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Soluzione di decontaminazione RNaseZap</td>
			<td>Fisher Scientifico</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pcr a verme singolo: un metodo per estrarre e amplificare il dna genomico

Single Worm PCR: A Method to Extract and Amplify Genomic DNA

Fonte: Prior, H., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">Una pipeline rapida e facile per la generazione di mutanti puntiformi genomici in C. elegans utilizzando ribonucleoproteine CRISPR/Cas9.</a>J. Vis. Exp.(2018).
Questo video descrive una tecnica per selezionare rapidamente un singolo nematode alla ricerca di un marcatore genetico mediante screening PCR. Nel protocollo di esempio, esaminiamo l'editing del genoma basato su CRISPR.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/20133/20133fig1.jpg"> 
Figura 1. Ingegneria CRISPR-Cas9 del locus di C. eleganssod-1. (A) Illustrazione schematica che raffigura la struttura esone-introne del locus sod-1 in C. elegans. La barra rossa indica la posizione di G93 nell'esone 3. Il set di coppie di inneschi è indicato dalle frecce rosse (F1-R1). (B) Allineamento di sequ...

PCR a verme singolo: un metodo per estrarre e amplificare il DNA genomico

Fonte: Prior, H., et al. Una pipeline rapida e facile per la generazione di mutanti puntiformi genomici in C. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ...

- Per l'analisi PCR di un singolo verme, consentire a un verme ermafrodita di autofecondarsi e deporre uova che produrranno una prole geneticamente identica e quindi preservare una copia del ceppo modificato. Quindi, trasferire il genitore in una provetta contenente tampone di lisi dei vermi. Congelare il tubo a meno 80 gradi Celsius per aprire la cuticola o lo strato esterno. Riscaldare il campione a più di 60 gradi Celsius per lisare le cellule del verme che rilasciano le proteine intracellulari insieme al DNA genomico della cellula. A questa temperatura, la proteinasi K all'interno del tampone degrada le proteine, in particolare le nucleasi che altrimenti distruggerebbero il DNA genomico. Quindi, aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius per inattivare l'enzima. Infine, aggiungere il lisato cellulare a una provetta con una miscela master PCR composta da tampone di reazione, dNTP, primer diretti e inversi per la regione di interesse, taq polimerasi e acqua portando la reazione al volume finale desiderato. Per eseguire la PCR, eseguire il programma di termociclatore appropriato che amplifica la regione del DNA di interesse. Nell'esempio seguente, vedremo una procedura PCR per lo screening degli eventi di editing CRISPR-Cas9 nel DNA genomico di singoli vermi F1. - Dopo 1 o 2 giorni di deposizione delle uova, utilizzare una pistola a vite senza fine per trasferire gli F1 in singoli tappi di provette per strisce PCR contenenti 7 microlitri di tampone di lisi caldo. Centrifugare le provette per PCR alla massima velocità e temperatura ambiente per un minuto per portare gli animali sul fondo della provetta. Quindi, congelare i tubi a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi, lisare i vermi congelati in un termociclatore utilizzando il seguente programma. Quindi, impostare una miscela master PCR come mostrato in questa tabella. Aggiungere 21 microlitri di PCR master mix in provette PCR pulite. Quindi, aggiungere 4 microlitri di provetta per lisi dei vermi e mescolare bene pipettando. Quindi, eseguire il programma PCR seguendo le linee guida del produttore.

single-worm-pcr-a-method-to-extract-and-amplify-genomic-dna

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4.8K Views. - Per l'analisi PCR di un singolo verme, consentire a un verme ermafrodita di autofecondarsi e deporre uova che produrranno una prole geneticamente identica e quindi preservare una copia del ceppo modificato. Quindi, trasferire il genitore in una provetta contenente tampone di lisi dei vermi. Congelare il tubo a meno 80 gradi Celsius per aprire la cuticola o lo strato esterno. Riscaldare il campione a più di 60 gradi Celsius per lisare le cellule del verme che rilasciano le proteine i...

Abstract

Protocol

<img title="figure-results-1" alt="figure-results-1" src="/files/ftp_upload/20133/20133fig1.jpg"> 
Figura 1. Ingegneria CRISPR-Cas9 del locus di C. eleganssod-1. (A) Illustrazione schematica che raffigura la struttura esone-introne del locus sod-1 in C. elegans. La barra rossa indica la posizione di G93 nell'esone 3. Il set di coppie di inneschi è indicato dalle frecce rosse (F1-R1). (B) Allineamento di sequ...

PCR a verme singolo: un metodo per estrarre e amplificare il DNA genomico

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Nome	Azienda	Numero di catalogo
Acqua priva di nucleasi	Synthego Inc.	fornito con il kit sgRNA EZ kit
KCl	sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Ricerca Zymo	D4004
Kit di recupero del DNA in gel Zymoclean	Ricerca Zymo	D4002
Q5 Hot Start Mix Master 2X ad Alta Fedeltà	Biolaboratori del New England	Codice: M0494L
Proteinasi K	sigma	P2308
MgCl2	sigma	Codice: M2393
NP-40	sigma	Codice: 74385
Tween-20	Fisher Scientifico	BP337-100
Soluzione di decontaminazione RNaseZap	Fisher Scientifico	AM9780