PCR a verme singolo: un metodo per estrarre e amplificare il DNA genomico

In questo articolo

Abstract

Fonte: Prior, H., et al. Una pipeline rapida e facile per la generazione di mutanti puntiformi genomici in C. elegans utilizzando ribonucleoproteine CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

Questo video descrive una tecnica per selezionare rapidamente un singolo nematode alla ricerca di un marcatore genetico mediante screening PCR. Nel protocollo di esempio, esaminiamo l'editing del genoma basato su CRISPR.

Protocollo

Il seguente protocollo è un estratto da Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR e genotipizzazione a verme singolo

Dopo 1 - 2 giorni di deposizione delle uova, trasferire gli F₁in singoli tappi di provette per PCR contenenti 7 μL di tampone per lisi dei vermi utilizzando un plettro (Tabella 1, Figura 1D, giorni 4 - 5).
Centrifugare le provette per PCR alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per portare gli animali sul fondo della provetta e congelare le provette a -80 °C per 1 h.
NOTA: I vermi possono essere conservati a -80 °C a tempo indeterminato.
Lizzare i vermi congelati in un termociclatore utilizzando il seguente programma: 60 °C per 60 min, 95 °C per 15 min, 4 °C hold.
Impostare la mastermix PCR come mostrato nella Tabella 2.
Aggiungere 21 μl di mastermix per PCR in provette per PCR pulite, quindi aggiungere 4 μl di lisi a vite senza fine dalla fase 3. Mescolare bene utilizzando una pipetta ed eseguire il programma PCR seguendo le linee guida del produttore (vedere la tabella dei materiali).
Purificare le reazioni PCR utilizzando un kit DNA Clean and Concentrate, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Eluire il DNA aggiungendo 10 μL di acqua alla colonna di centrifuga.
Mastermix enzimatico di restrizione all'impostazione come mostrato nella Tabella 3.
Aggiungere 10 μl di mastermix dell'enzima di restrizione a ciascuna reazione PCR pulita e incubare per 1 - 2 ore a 37 °C.
I prodotti PCR digeriti separati su un gel di agarosio all'1,5% vengono eseguiti a 120 V utilizzando 1 tampone Tris-acetato-EDTA (TAE).

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Risultati

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Figura 1. Ingegneria CRISPR-Cas9 del locus di C. eleganssod-1. (A) Illustrazione schematica che raffigura la struttura esone-introne del locus sod-1 in C. elegans. La barra rossa indica la posizione di G93 nell'esone 3. Il set di coppie di inneschi è indicato dalle frecce rosse (F1-R1). (B) Allineamento di sequ...