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Abstract

Fonte: Escorcia, W., et al. Quantificazione dell’abbondanza lipidica e valutazione della distribuzione lipidica in Caenorhabditis elegans mediante colorazione con rosso Nilo e rosso olio O. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive un protocollo per colorare i lipidi in vermi interi e fissi utilizzando il colorante Nile Red. Per visualizzare in modo specifico i lipidi neutri nel nucleo delle goccioline lipidiche, visualizza gli spettri di emissione verde del C. elegans colorato.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Colorazione dei lipidi con rosso Nilo (NR)

1. Preparazione di 5 mg/mL di soluzione madre NR
   1. In un flacone da 500 ml, aggiungere 100 mg di polvere NR a 200 ml di acetone al 100%.
   2. Copri la bottiglia con un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce.
   3. Prima dell’uso, mescolare la soluzione per 2 ore al buio.
   4. Per un uso a lungo termine, conservare la soluzione madre NR in un flacone ermeticamente chiuso senza alcuna esposizione alla luce. Scala la soluzione stock NR in base alle esigenze di ricerca. Assicurarsi che la stessa soluzione madre venga utilizzata negli esperimenti di colorazione NR per ottenere risultati di colorazione e imaging coerenti.
2. Preparazione della soluzione di lavoro NR
   1. Per ogni 1 mL di isopropanolo al 40% (v/v), aggiungere 6 μL di soluzione madre NR.
   2. Preparare 600 μl di soluzione di lavoro NR per ogni campione.
      NOTA: Preparare una nuova soluzione di lavoro NR subito prima della colorazione. A seconda delle esigenze della soluzione madre NR, utilizzare una provetta conica graduata da 15 mL o 50 mL.
3. Preparazione di vermi per la colorazione dei lipidi NR
   1. Far crescere i vermi fino allo stadio L4 precoce a 20 °C su terreno di crescita per nematodi (NGM) seminato con E. coli OP50 a log tardivo.
   2. Lavare i vermi dalla piastra con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x + Triton X-100 (PBST) allo 0,01% e mettere la sospensione di vermi in una provetta microfuge da 1,5 mL.
   3. Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 minuto. Rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio fino a quando E. coli non viene eliminato dalla sospensione.
   4. Aggiungere 100 μl di isopropanolo al 40% al pellet di vermi e incubarlo a temperatura ambiente per 3 minuti.
   5. Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 minuto e rimuovere il surnatante senza distruggere il pellet di vermi.
      NOTA: Utilizzare volumi più elevati di PBST per lavare via i vermi dalle piastre se si utilizzano lastre più grandi o si colorano più vermi per piastra. Non lavare i vermi in PBST più di 15 minuti prima della fissazione del campione. Eseguire ulteriori lavaggi se il surnatante non è privo di batteri. Effettuare l’incubazione in isopropanolo al 40% utilizzando un nutatore o un bilanciere. Monitorare sempre le provette per assicurarsi che si verifichi l’agitazione completa del campione.
4. Colorazione lipidica con NR
   1. Al buio, aggiungere 600 μL di soluzione di lavoro NR a ciascun campione. Capovolgere le provette tre volte e mescolare completamente i vermi in soluzione NR.
   2. Ruotare il campione al buio a temperatura ambiente per 2 ore.
   3. Dopo l’incubazione, centrifugare i vermi a 560 x g per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
   4. Aggiungere 600 μl di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti per rimuovere la colorazione NR in eccesso.
   5. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 minuto e rimuovere tutti i campioni di surnatante tranne circa 50 μl.
      NOTA: L’incubazione NR non richiede agitazione. L’insediamento dei vermi è comune durante questa fase.
5. Preparazione di vetrini per l’imaging al microscopio
   1. Risospendere il pellet di verme nel surnatante rimanente.
   2. Posizionare 5 μl di sospensione di vermi su un vetrino da microscopio e applicare con cura un vetrino coprioggetti per evitare di intrappolare bolle d’aria.
   3. Sigillare il vetrino coprioggetti con smalto per unghie prima di eseguire l’imaging dei vermi.
   4. Prepara solo un paio di diapositive alla volta. Ciò garantirà che l’imaging NR rimanga costante tra i campioni. La qualità delle immagini colorate NR diminuisce dopo 6 ore. Le goccioline lipidiche discrete sono difficili da osservare e la fluorescenza di fondo aumenta, il che interferisce con il rilevamento del segnale NR.
6. Imaging di vermi colorati con NR
   1. Fotografa i vermi con un ingrandimento 5X per catturare diversi animali per campo visivo.
   2. Passa all’ingrandimento 10X per una migliore quantificazione dei singoli vermi.
   3. Utilizzare il canale FITC/GFP per visualizzare i vermi colorati con NR e provare diversi tempi di esposizione per determinare le condizioni ottimali per la quantificazione.
   4. Salva i file in formato TIF per evitare di perdere dati a causa della compressione.
      NOTA: I tempi di esposizione tipici variano da 100 a 1000 ms. Avendo un tempo di esposizione ottimale, utilizzarlo per tutti i campioni per mantenere la coerenza dell’imaging.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator