Questo protocollo è un estratto da Clarke et al, Manipolazione della ploidia in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
I ceppi tetraploidi possono essere convalidati contando il numero di cromosomi nei loro ovociti non fecondati. La microscopia fluorescente può essere utilizzata per lo screening del numero di coppie cromosomiche in ovociti diploidi non fecondati (prima delle divisioni meiotiche), se il ceppo ha un marcatore fluorescente per i cromosomi. In assenza di marcatori cromosomici fluorescenti, i nematodi tetraploidi possono essere sottoposti a screening fissando i nematodi e colorandoli con un colorante a DNA; vedi sotto per un protocollo per la fissazione dell'etanolo e la colorazione con 4′,6-diamidina-2′-fenilindolo dicloridrato (DAPI) su animali interi.
Colorazione DAPI dell'intero animale
NOTA: I ceppi tetraploidi che trasportano 12 coppie di cromosomi connessi possono essere convalidati colorando questi animali con il DAPI e contando il numero di corpi DAPI nei suoi ovociti non fecondati.
- Posizionare da 5 a 10 μl di tampone M9 su un vetrino da microscopio, quindi trasferire 6-10 nematodi nella goccia.
- Sotto un microscopio da dissezione, prelevare la maggior parte dell'M9 dalla goccia senza rimuovere i nematodi con un panno di pulizia privo di lanugine. Quindi, aggiungere immediatamente una goccia di 10 μl di etanolo al 90% sui vermi. Lasciare asciugare completamente i vermi, ma per non più di un paio di secondi.
- Non appena l'etanolo evapora (questo può essere visto come accade al microscopio da dissezione), aggiungere altri 10 μL di etanolo al 90% sui vermi.
- Ripetere il passaggio 3.1.3 altre tre volte.
- Una volta evaporata l'ultima goccia di etanolo, aggiungere 6 μl di colorante DAPI o Hoechst alla concentrazione finale raccomandata nel mezzo di montaggio scelto (ad esempio, una diluizione 1:1.000 di una concentrazione stock DAPI di 2 ng/μl in M9). Per la conservazione a lungo termine dei vetrini, può essere utilizzato lo 0,5% di p-fenilendiammina disciolta in 20 mM di Tris-HCl, pH 8,8, in glicerolo al 90% come soluzione antisbiadimento, invece del solo M9.
- Coprire i vermi sul vetrino con un vetrino coprioggetti e sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con smalto per unghie. Segnare in un microscopio a fluorescenza (passaggio 3.1.7) almeno 10 minuti dopo l'aggiunta del vetrino coprioggetti. I vetrini senza anti-sbiadimento possono essere conservati per alcuni giorni a 4 °C prima di incidere, ma la qualità della fluorescenza inizia a diminuire dopo pochi giorni.
- Utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100X, è possibile valutare il numero di singoli corpi DAPI (presumibilmente singole coppie di cromosomi) nell'ovocita non fecondato più maturo, che è immediatamente adiacente alla spermateca e non è ancora entrato nella spermateca o nell'utero.
- Per valutare i singoli corpi DAPI all'interno del nucleo di un ovocita, utilizzare la messa a fuoco fine del microscopio per spostarsi lentamente dalla parte superiore del nucleo dell'ovocita verso il basso durante il conteggio. Quindi, contare lo stesso nucleo mentre si sposta il fuoco nella direzione opposta (cioè dal basso verso l'alto del nucleo) per confermare il numero contato di corpi DAPI.
- Segnare l'ovocita non fecondato più maturo in ciascuna delle due gonadi in almeno dieci ermafroditi per ceppo stabile di Lon. Gli ovociti wild type hanno in media 6 corpi DAPI, 5 coppie di autosomi e la coppia di cromosomi sessuali. La presenza di 12 corpi DAPI nell'ovocita di ceppi stabili di Lon indica che gli animali di questo ceppo sono tetraploidi parziali (4 serie di autosomi, 3 cromosomi X) o completi (4 serie di autosomi, 4 cromosomi X).
- Calcolare il numero medio di corpi DAPI osservati da più (almeno 10) ovociti per ceppo. Alcune coppie di cromosomi si toccano o si sovrappongono, quindi il numero di corpi DAPI in un ovocita è spesso inferiore al numero effettivo di coppie di cromosomi.
- (Facoltativo) Convalidare ulteriormente i ceppi di Lon stabili in cui il numero medio di corpi DAPI è 12 per verificare se sono tetraploidi completi (4A, 4X) o parziali (4A, 3X) mediante colorazione in immunofluorescenza contro le proteine dell'asse cromosomico come HTP-3. Questa colorazione distinguerà le coppie di cromosomi mostrando un pattern cruciforme da singoli cromosomi non connessi presenti nel tetraploide parziale.
