$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Il seguente protocollo è un estratto da Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).
SWIP
NOTA: Descriviamo il metodo manuale di valutazione SWIP nei worm wild-type trattati con AMPH. Discutiamo anche brevemente il tracciamento dei vermi e ulteriori analisi della cinetica dei vermi utilizzando un tracker automatico di vermi e un software di tracciamento, che sono stati precedentemente descritti da Hardaway et al.
- Metodo manuale per testare la SWIP
- Aliquotare 40 μL di soluzione di saccarosio 200 mOsm/L con o senza 0,5 mM AMPH in una piastra spot di vetro. Sotto lo stereoscopio, raccogli 8-10 vermi allo stadio tardivo L4 con un plettro per ciglia o platino e immergi il plettro nella piastra contenente la soluzione fino a quando i vermi non si staccano dal plettro e nuotano nella soluzione. Annotare il numero di vermi raccolti nel pozzo, avviare il timer, osservare e registrare il numero di vermi che mostrano SWIP ad ogni minuto.
- Copia i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcola la percentuale di vermi paralizzati dividendo il numero di vermi paralizzati in ogni minuto per il numero totale di vermi testati durante il test e moltiplicando per 100. Copia i valori percentuali in qualsiasi software grafico e statistico e traccia i dati con i valori percentuali sull'asse Y e il tempo sull'asse X utilizzando il formato grafico XY.
- Eseguire l'ANOVA a due vie seguita da un'analisi post-hoc (ad es. Bonferroni post-test) per testare la significatività statistica tra il controllo, i gruppi AMPH e il tempo di trattamento.
- Analisi automatizzata di SWIP
- Esegui analisi automatizzate su un singolo worm alla volta. Il protocollo per configurare la telecamera, il software di tracciamento dei worm e lo script per eseguire l'analisi del software di tracciamento sono descritti in dettaglio in Hardaway et al.
- In breve, posizionare un singolo ermafrodita dello stadio tardivo L4 in una piastra di vetro utilizzando un plettro per ciglia, come descritto nel metodo manuale nella sezione 1.1.2. Registra video di nuoto di un verme alla volta e utilizza il software di tracciamento dei vermi per calcolare la frequenza dei piegamenti del corpo.
- Seguire lo script fornito con il software di tracciamento per ottenere la frequenza di thrashing dei worm e generare mappe di calore dai dati di thrashing dei worm.