Placcatura dell'RNAi per l'alimentazione di C. elegans: una tecnica per indurre l'espressione del dsRNA bersaglio in E. coli

Abstract

Fonte: Kolundzic, E., et al. Applicazione dell'RNAi e dell'espressione del fattore di trascrizione indotta dallo shock termico per riprogrammare le cellule germinali in neuroni in C. elegans.(2018).

Questo video descrive i principi alla base del trattamento con RNAi in C. elegans e dimostra un protocollo per abbattere il lin-35 in un ceppo di verme transgenico.

Protocollo

Questo protocollo è estratto da Kolundzic, et al, Applicazione dell'RNAi e dell'espressione del fattore di trascrizione indotta dallo shock termico per riprogrammare le cellule germinali in neuroni in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Preparazione della soluzione
   1. Piastre NGM-Agar (1 L)
      1. Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di terreno peptonico (ad es. Bacto-Peptone) e 20 g di agar. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in sto....

Risultati

Figura 1: Fenotipo di Pvul causato da RNAi contro lin-53. (In alto) Immagine DIC di vermi progenie L4/giovani adulti allo stadio F1 derivati da madri trattate con RNAi di controllo o lin-53. Barre della scala = 20 μm. (In basso) Gli animali trattati con lin-53 RNAi mostrano il fenotipo della vulva sporgente (pvul) (punte di freccia nere). Il fenotipo pvul conferma che .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Chimica
Agar-Agar, Kobe I	Roth	Codice 5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	Codice: 211 677	Peptone Media
Estratto di lievito	AppliChem	A1552,0100
Amfotericina B	USBiologico	Codice: A2220
CaCl2	Merck Bioscienze	Codice 208290
Colesterolo	Roth	8866.2
Gelatina	Roth	4275.3
IPTG	sigma	Codice 15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR	25.163.364
Na2HPO4	Roth	P030.1
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Carbenicillina	Roth	634412
Tetraciclina	Roth	Codice 2371.2
Incubatori
Incubatrice	Sanyo MIR-5	5534210	per il mantenimento di ceppi di vermi a 15 °C o 25 °C
Microscopi
Stereomicroscopio	SMZ745	Nikon
Ceppi batterici
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lisosogeno: lavUV5promoter -T7 polimerasi) (T7 polimerasi inducibile da IPTG) (RNAseIII minus).
Escherichia coli OP50			Uracil auxotropo ceppo E. coli
Ceppi di vermi
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			derivato da OH9846 da 4 volte più incrocio posteriore con N2
Cloni >RNAi
lin-53	FonteBioscienze	ID I-4D14	Libreria Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
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