Alimentazione dell'RNAi in coltura liquida: un metodo ad alto rendimento per abbattere l'espressione genica in C. elegans

Abstract

Fonte: Groh, N. et al. Metodi per studiare i cambiamenti nell'aggregazione proteica intrinseca con l'età in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi è un potente strumento genetico a disposizione dei ricercatori di C. elegans. Questo video presenta un metodo per trattare più vermi con RNAi rispetto all'alimentazione su piastra utilizzando condizioni di coltura liquida.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Groh et al, Metodi per studiare i cambiamenti nell'aggregazione proteica intrinseca con l'età in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Coltura liquida di animali senza gonadi per raccogliere animali giovani e anziani sottoposti a RNAi mirato a un gene di interesse

NOTA: La risposta di alcuni geni all'RNAi può dipendere dalla temperatura, come descritto in precedenza. In alternativa all'RNAi, un gene mutante potrebbe essere incorporato nel background gon-2(-).

1. Preparazione di batteri per colture liquide
   1. Preparare i batteri OP50 e RNAi (batteri che producono il dsRNA desiderato e batteri con il vettore vuoto come controllo) inoculando 4 L LB di terreno con 12 mL della rispettiva coltura batterica (aggiungere una concentrazione finale di 50 μg/mL di carbenicillina e 1 mM di IPTG alle colture batteriche RNAi) e incubarli a 37 °C per una notte a 180 giri/min.
   2. Il giorno successivo raccogliere le colture a 6.700 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere i surnatanti e risospendere ogni pellet in 60 mL di terreno basale S ghiacciato (100 mM NaCl, 50 mM di fosfato di potassio pH 6, mantenuto in ghiaccio). Mantenere i tre pellet risospesi (OP50, batteri RNAi di controllo e batteri RNAi per il gene di interesse) a 4 °C fino al passaggio 1.2.
      NOTA: I vermi possono essere coltivati su RNAi dallo stadio L1 o per evitare difetti di sviluppo dall'ultimo stadio larvale L4 (vedi passaggio 1.2).
2. Coltura liquida per il trattamento con RNAi a partire dall'ultimo stadio larvale L4
   1. Aggiungere 200 mL di terreno basale S in un pallone di coltura Fernbach (capacità 2.800 mL). Per un volume di coltura finale di 300 mL (vedere 1.2.2.4), aggiungere 10 mM di citrato di potassio, pH 6, 3 mL di soluzione di metalli in tracce (5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,5 mM di FeSO₄, 1 mM di MnCl₂, 1 mM di ZnSO₄, 0,1 mM di CuSO₄), 3 mM di MgSO₄, 3 mM di CaCl₂, 100 ng/mL di carbendazim e 5 μg/mL di colesterolo). Chiudere il pallone con un tappo a vite a membrana. Fare riferimento alla Tabella 1 per le ricette dei tamponi.
   2. Prelevare gli L1 da 25 °C e trasferirli in provette da 15 mL. Centrifugare a 1.900 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante e contare gli L1 per 2 μl. Aggiungere 500.000 L1 nel pallone di coltura Fernbach preparato nel passaggio precedente.
   3. Aggiungere OP50 (dal passaggio 1.1) proporzionalmente al numero di worm. Ad esempio, per 500.000 vermi aggiungere 60 ml di OP50.
   4. Coltura completa di vermi con S basale per portare il volume totale a 300 mL. Incubare la coltura di vermi fino allo stadio L4 a 25 °C in un'incubatrice vibrante a 150 giri/min.
   5. Il giorno successivo, i vermi dovrebbero avere le dimensioni di L4 wild-type. Per passare dai batteri OP50 a quelli RNAi, raccogliere gli animali in sei provette da 50 ml, lasciarli sedimentare e rimuovere il surnatante. Lavare gli L4 con M9 per rimuovere i residui di batteri OP50: centrifugare a 1900 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante e trasferire tutti gli L4 in una provetta da 50 ml. Contare gli L4 per 5 μl (almeno nove volte). Due volte 50.000 L4 sono necessari per la raccolta dei giovani vermi e due volte 100.000 L4 per la raccolta dei giovani vermi.
   6. Preparare quattro fiasche di coltura Fernbach come descritto al punto 1.2.2.1. Aggiungere anche una concentrazione finale di 50 μg/mL di carbenicillina e 1 mM di IPTG a ciascun pallone.
   7. Aggiungere i batteri RNAi di controllo e i batteri RNAi per il gene di interesse (dal passaggio 1.1) proporzionalmente al numero di vermi: aggiungere 7 ml dei rispettivi batteri per pallone per i vermi giovani e 14 ml per pallone per i vermi invecchiati.
   8. Aggiungere 50.000 vermi per pallone per la raccolta di vermi giovani e 100.000 vermi per pallone per la raccolta di vermi invecchiati e completare le colture con S basal per riempire fino a 300 ml. Incubare le colture di vermi (quattro in totale) a 25 °C e 150 giri/min.

2. Mantenimento delle colture liquide di C. elegans

1. Prelevare periodicamente un'aliquota da ogni coltura liquida e posizionarla su un vetrino (in alternativa su una piastra di agar) per verificare che non vi siano contaminazioni. Utilizzando un microscopio da dissezione, controllare i livelli di cibo batterico nella coltura, soprattutto durante la fase di crescita. Preparare in anticipo 2 L di batteri RNAi di controllo e batteri RNAi per il gene di interesse, come descritto al punto 1.1. Se necessario, aggiungerli ai fermenti liquidi di C. elegans e mantenere il resto a 4 °C.
2. Controllare periodicamente che gli animali siano sterili. La maggior parte degli animali non avrà una gonade. A seconda della penetranza della mutazione di gon-2, alcuni possono avere strutture gonadiche abortite, ma non devono essere osservati animali con uova.

Soluzione madre	importo	Concentrazione finale	Commenti/Descrizione
S basale (per 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Fosfato di potassio pH 6)	200 ml		1 M Fosfato di potassio pH 6: Per 1 L: 129 g KH2PO4 monobasico, 52 g K2HPO4 bibasico anidro
1 M Citrato di potassio pH 6 (Per 400 ml: 13,1 g di acido citrico monoidrato, 134,4 g di citrato tripotassico monoidrato)	3 ml	10 mM
Tracce di metalli in soluzione (Per 1 L: 1,86 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,69 g di FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Conservare la soluzione madre al buio a 4 °C
1 M MgSO4 (per 500 mL: 123,3 g)	900 μl	3 mM
1 M di CaCl2 (per 500 mL: 73,5 g)	900 μl	3 mM
200 μg/mL di Carbendazim (Per 50 ml: 10 mg in metanolo)	150 μl	100 ng/mL
5 mg/mL di colesterolo (Per 100 ml: 0,5 g in etanolo)	300 μl	5 μg/mL

Tabella 1.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fiaschetta di coltura Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, capacità 2.800 ml, con 3 rientranze del deflettore	Sì
Tappo a vite a membrana	Schott	1E+06	GL45	Sì
Miscelatore nutante	VWR	444-0148		Sì
Imbuto separatore	Nalgene	4300-1000	Capacità 1.000 ml	No
Siringa da 1 ml	BD Plastipak	3E+05		No
Ago grigio, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlancia 3	3E+05		No
Filtri a membrana 0,025 μM	Millipore	VSWP04700		No
Striscia di pH	Machery-Nagel	Codice 92110	pH-Fix 0-14	No
Cocktail di inibitori della proteasi	Roche	5E+09	Compresse complete Mini senza EDTA	No
Octoxynol-9	Applichem	Codice: A1388	Triton X-100	No
Acido 4-morfolinetsolfonico (MES)	Sigma-Aldrich	Motore M1317		No
Nonilfenilpolietilenglicole	Applichem	Codice: A1694	Nonidet P40 (NP40)	No
DNaseI	Roche	5E+09	ricombinante, senza RNasi	No
RNaseA	Promega	Codice: A7973	soluzione	No
Colorazione con blot proteico totale	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot colorante	No
Colorazione totale del gel proteico	Thermofisher	Episodio 12001	Sypro Ruby protein gel colorante	No
TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato)	Serva	Codice: 36970		No
Iodoacetammide	Serva	Codice 26710		No
Ammoniobicarbonato	Sigma-Aldrich	Codice: 9830		No
Grado di sequenziamento Tripsina modificata	Promega	V5111		No
Tag isobarici per quantificazione relativa e assoluta	Sciex	4E+06	Kit multiplex di reagenti iTRAQ	No
Centrifuga Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05		Sì
Ultracentrifuga Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05		No
Centrifuga 5424R	Eppendorf	5E+09		Sì
Centrifuga 5702	Eppendorf	6E+09		Sì
Centrifuga Megafuge 40R	Termo Scientifico	8E+07		No
Concentratore Plus	Eppendorf	5E+09	Evaporatore centrifugo	No
Stereomicroscopio a fluorescenza M165 FC	Leica		Con obiettivo Planapo 2.0x	No
Microscopio di dissezione	Leica		Leica S6E	Sì
Microscopio ad alto ingrandimento Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		Con obiettivo PlanAPOCHROMAT 20x e Zeiss Axio Cam MRm	No
software				No
Software di analisi delle immagini	ImmagineJ			No
Analisi dei dati di spettrometria di massa	Prospettore di proteine		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	No
Ceppi di E.coli
OP50	CGC
Batteri RNAi
L4440	Libreria RNAi di Julie Ahringer
Mutanti di C. elegans
Pannello CF2253	CGC, nome ceppo: EJ1158		Genotipo: gon-2(q388)
C. elegans transgenico
DCD214	Il laboratorio di Della David a DZNE Tübingen		Genotipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Il laboratorio di Della David a DZNE Tübingen		Genotipo: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]