Alimentazione dell'RNAi in coltura liquida: un metodo ad alto rendimento per abbattere l'espressione genica in C. elegans

Questo protocollo è un estratto da Groh et al, Metodi per studiare i cambiamenti nell'aggregazione proteica intrinseca con l'età in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Coltura liquida di animali senza gonadi per raccogliere animali giovani e anziani sottoposti a RNAi mirato a un gene di interesse

NOTA: La risposta di alcuni geni all'RNAi può dipendere dalla temperatura, come descritto in precedenza. In alternativa all'RNAi, un gene mutante potrebbe essere incorporato nel background gon-2(-).

1. Preparazione di batteri per colture liquide
   1. Preparare i batteri OP50 e RNAi (batteri che producono il dsRNA desiderato e batteri con il vettore vuoto come controllo) inoculando 4 L LB di terreno con 12 mL della rispettiva coltura batterica (aggiungere una concentrazione finale di 50 μg/mL di carbenicillina e 1 mM di IPTG alle colture batteriche RNAi) e incubarli a 37 °C per una notte a 180 giri/min.
   2. Il giorno successivo raccogliere le colture a 6.700 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere i surnatanti e risospendere ogni pellet in 60 mL di terreno basale S ghiacciato (100 mM NaCl, 50 mM di fosfato di potassio pH 6, mantenuto in ghiaccio). Mantenere i tre pellet risospesi (OP50, batteri RNAi di controllo e batteri RNAi per il gene di interesse) a 4 °C fino al passaggio 1.2.
      NOTA: I vermi possono essere coltivati su RNAi dallo stadio L1 o per evitare difetti di sviluppo dall'ultimo stadio larvale L4 (vedi passaggio 1.2).
2. Coltura liquida per il trattamento con RNAi a partire dall'ultimo stadio larvale L4
   1. Aggiungere 200 mL di terreno basale S in un pallone di coltura Fernbach (capacità 2.800 mL). Per un volume di coltura finale di 300 mL (vedere 1.2.2.4), aggiungere 10 mM di citrato di potassio, pH 6, 3 mL di soluzione di metalli in tracce (5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,5 mM di FeSO₄, 1 mM di MnCl₂, 1 mM di ZnSO₄, 0,1 mM di CuSO₄), 3 mM di MgSO₄, 3 mM di CaCl₂, 100 ng/mL di carbendazim e 5 μg/mL di colesterolo). Chiudere il pallone con un tappo a vite a membrana. Fare riferimento alla Tabella 1 per le ricette dei tamponi.
   2. Prelevare gli L1 da 25 °C e trasferirli in provette da 15 mL. Centrifugare a 1.900 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante e contare gli L1 per 2 μl. Aggiungere 500.000 L1 nel pallone di coltura Fernbach preparato nel passaggio precedente.
   3. Aggiungere OP50 (dal passaggio 1.1) proporzionalmente al numero di worm. Ad esempio, per 500.000 vermi aggiungere 60 ml di OP50.
   4. Coltura completa di vermi con S basale per portare il volume totale a 300 mL. Incubare la coltura di vermi fino allo stadio L4 a 25 °C in un'incubatrice vibrante a 150 giri/min.
   5. Il giorno successivo, i vermi dovrebbero avere le dimensioni di L4 wild-type. Per passare dai batteri OP50 a quelli RNAi, raccogliere gli animali in sei provette da 50 ml, lasciarli sedimentare e rimuovere il surnatante. Lavare gli L4 con M9 per rimuovere i residui di batteri OP50: centrifugare a 1900 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante e trasferire tutti gli L4 in una provetta da 50 ml. Contare gli L4 per 5 μl (almeno nove volte). Due volte 50.000 L4 sono necessari per la raccolta dei giovani vermi e due volte 100.000 L4 per la raccolta dei giovani vermi.
   6. Preparare quattro fiasche di coltura Fernbach come descritto al punto 1.2.2.1. Aggiungere anche una concentrazione finale di 50 μg/mL di carbenicillina e 1 mM di IPTG a ciascun pallone.
   7. Aggiungere i batteri RNAi di controllo e i batteri RNAi per il gene di interesse (dal passaggio 1.1) proporzionalmente al numero di vermi: aggiungere 7 ml dei rispettivi batteri per pallone per i vermi giovani e 14 ml per pallone per i vermi invecchiati.
   8. Aggiungere 50.000 vermi per pallone per la raccolta di vermi giovani e 100.000 vermi per pallone per la raccolta di vermi invecchiati e completare le colture con S basal per riempire fino a 300 ml. Incubare le colture di vermi (quattro in totale) a 25 °C e 150 giri/min.

2. Mantenimento delle colture liquide di C. elegans

1. Prelevare periodicamente un'aliquota da ogni coltura liquida e posizionarla su un vetrino (in alternativa su una piastra di agar) per verificare che non vi siano contaminazioni. Utilizzando un microscopio da dissezione, controllare i livelli di cibo batterico nella coltura, soprattutto durante la fase di crescita. Preparare in anticipo 2 L di batteri RNAi di controllo e batteri RNAi per il gene di interesse, come descritto al punto 1.1. Se necessario, aggiungerli ai fermenti liquidi di C. elegans e mantenere il resto a 4 °C.
2. Controllare periodicamente che gli animali siano sterili. La maggior parte degli animali non avrà una gonade. A seconda della penetranza della mutazione di gon-2, alcuni possono avere strutture gonadiche abortite, ma non devono essere osservati animali con uova.

Tabella 1.