Saggio dell'olfattometro a quattro vie: un metodo per valutare le risposte degli odori in Drosophila

Abstract

Fonte: Lin, C.C., et al. Comportamenti olfattivi analizzati dal monitoraggio computerizzato della Drosophila in un olfattometro a quattro quadranti. J. Vis. Exp. (2016).

I moscerini della frutta hanno un sistema olfattivo complesso, possono discriminare centinaia di odori e usano il loro senso dell'olfatto per indirizzare le decisioni comportamentali. Questo video descrive il test dell'olfattometro a quattro vie, un metodo per studiare le risposte comportamentali olfattive nei moscerini. La clip del protocollo in primo piano mostra come gestire le mosche di prova e quali sono i passaggi critici durante l'esecuzione del test.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Lin et al., Comportamenti olfattivi analizzati dal monitoraggio computerizzato della Drosophila in un olfattometro a quattro quadranti, J. Vis. Exp. (2016).

1. Risposte comportamentali agli odori attraenti e repellenti

1. Accendere il termoregolatore e impostarlo a 25 °C.
2. Collegare le camere degli odori (controllo e test degli odorizzanti) inserendo il tubo all'uscita della camera degli odori e al raccordo a pressione sulla scatola di comportamento.
3. Controllare la portata in ciascun quadrante utilizzando il flussometro per assicurarsi che i flussi d'aria di controllo e odorizzanti siano pari a 100 ml/min.
4. Pulire l'arena di mosca in PTFE e le lastre di vetro con etanolo al 70% 2-3 volte e lasciarle asciugare completamente all'aria (~3-4 min).
5. Fissare le lastre di vetro all'arena con i morsetti.
6. Trasferire le mosche senza anestesia con CO₂ nell'arena attraverso il foro in una delle lastre di vetro. Dopo il trasferimento, posiziona una rete circolare sul foro per evitare che le mosche fuoriescano.
   NOTA: È stato dimostrato che l'anestesia con CO₂ influisce sul comportamento della Drosophila e non deve essere utilizzata entro 24 ore da un esperimento comportamentale.
7. Posizionare l'arena con le mosche nella camera a tenuta di luce, collegare i quattro flussi d'aria di controllo collegando il tubo collegato al raccordo push-to-connect sulla scatola di comportamento agli angoli dell'arena, chiudere la porta della camera e attendere 10-15 minuti per consentire alle mosche di acclimatarsi al nuovo ambiente. Se possibile, spegnere le luci nella stanza in cui vengono eseguiti gli esperimenti, per evitare possibili perdite di luce minime che potrebbero influenzare l'esito dell'esperimento.
8. Esegui un esperimento di controllo di 5-10 minuti, in cui le mosche sono esposte a 4 flussi d'aria di controllo.
9. Analizza immediatamente i dati (vedi la sezione Analisi dei dati di seguito) per assicurarti che le mosche siano distribuite uniformemente nell'arena e che l'indice di attrazione sia vicino a 0. Questo passaggio è essenziale, in quanto verifica che non vi siano fonti incontrollate di preferenza o di evitamento all'interno dell'arena (ad es. luce che fuoriesce dall'esterno, distribuzione irregolare della temperatura, arena irregolare, contaminazione da odori, ecc.). Se le mosche sono distribuite in modo non uniforme o la loro attività locomotoria è bassa, scartare le mosche, pulire nuovamente l'arena (Passaggio 1.4) e utilizzare un nuovo lotto di mosche per ripetere l'esperimento.
10. Collegare la camera dell'odorizzante di prova alla configurazione accendendo le valvole a 3 vie o ricollegando i tubi di connessione.
11. Eseguire l'esperimento di test per 5-10 minuti e analizzare i dati come illustrato nella sezione 2 di seguito (Figura 1). Le registrazioni più lunghe di 20 minuti possono generare file di dati che potrebbero essere difficili da elaborare dal punto di vista computazionale. Se si desiderano registrazioni sperimentali più lunghe, interrompere e riavviare rapidamente il programma di tracciamento. Ciò si traduce in un intervallo di ~10 secondi tra le registrazioni sperimentali.
12. Scartare le mosche.
13. Pulire l'arena e le lastre di vetro con etanolo al 70% (passaggio 1.4) e sostituire i tubi di collegamento all'interno dell'involucro a tenuta di luce. Per accelerare gli esperimenti, è possibile utilizzare una nuova arena pulita e pulire l'arena sporca durante l'esecuzione di corse sperimentali.
14. Esegui un altro esperimento con un nuovo lotto di mosche, se necessario. Se vengono eseguiti più esperimenti nello stesso giorno, prestare la massima attenzione per assicurarsi che non rimangano odori nel sistema da un test precedente. Questo normalmente non è un problema con basse concentrazioni di odoranti o con CO₂, ma per stimoli altamente concentrati può essere necessario un intervallo di 24 ore tra le esecuzioni sperimentali. Inoltre, tutti i tubi dopo i tubi di flusso possono essere sostituiti se si sospetta una contaminazione da odorizzanti durante gli esperimenti di controllo. Lasciare sempre l'aria secca accesa tra gli esperimenti per lavare continuamente il sistema.

2. Analisi dei dati

NOTA: Il software di acquisizione del tracciamento delle mosche suggerito (dettagliato in Materiali), traccia le mosche in tempo reale durante l'acquisizione e salva il timestamp e le coordinate di tutte le mosche rilevate in formato *.dat. Abbiamo sviluppato una routine Matlab personalizzata per convertire i dati in un formato Matlab e per analizzare i dati. Esempi di codice sono forniti nei materiali supplementari, ma i dettagli dell'implementazione dipenderanno dal software utilizzato per l'acquisizione dei dati.

1. Caricare i dati non elaborati. Creare una maschera spaziale che segua i contorni dell'arena e applicare la maschera ai dati non elaborati per rimuovere tutti i punti dati che cadono all'esterno dell'arena in quanto rappresentano il rumore (Figura 2A, codice supplementare MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Rimuovi tutti i punti dati che si muovono a una velocità inferiore a 0,163 cm/s per più di 3 secondi, poiché è probabile che questi dati siano rumore o generati da mosche ferme (Figura 2B, Codice supplementare TemporalFiltering.m).
3. Visualizza i punti dati rimanenti tracciandoli tutti in una volta o come singole traiettorie (Figura 1, codice supplementare SingleTrajectoryViewer.m).
   NOTA: La posizione dei confini degli odori nei quattro campi dipende probabilmente da una serie di fattori, come le caratteristiche di ciascun odorizzante e le velocità del flusso d'aria utilizzate. Ad esempio, gli odori altamente volatili probabilmente riempiranno il quadrante degli odori più completamente rispetto agli odori meno volatili. Pertanto, è probabile che ogni odorante possa mostrare confini di odore leggermente diversi. L'uso di un rilevatore a fotoionizzazione per misurare i confini degli odori può essere problematico in quanto utilizza un vuoto per campionare l'aria da un punto particolare, interrompendo così la concentrazione di odori in quel punto. Tuttavia, i confini degli odori possono essere stimati rapidamente sulla base dei dati comportamentali delle mosche. Ad esempio, un limite di odore basato su tracce di mosca cumulate in risposta a diversi odori può essere chiaramente osservato in Figura 1C e 1D.
4. Calcolare un indice di attrazione per determinare se gli esperimenti di controllo non generano alcuna risposta di preferenza e anche per accedere alla risposta a uno stimolo odorizzante (o optogenetico). Per calcolare un indice di attrazione (AI), utilizzare gli ultimi 5 minuti di un controllo o di una registrazione di prova. Per ottenere una misura di attrazione compresa tra +1 (attrazione assoluta) e -1 (repulsione assoluta), la seguente formula viene utilizzata per calcolare l'AI:
   
   dove N_test è il numero di punti dati nel quadrante di test, N_control è il numero medio di punti dati nei tre quadranti di controllo. Questa misura è intuitiva in quanto nessuna preferenza sarebbe indicata da valori vicini allo zero. Tuttavia, non indica correttamente la proporzione del numero totale di mosche che si trovano nel quadrante degli odori. Per ottenere questa misura, può essere utilizzato un indice percentuale (PI):
   
   dove N_test è il numero di punti dati nel quadrante di test e N_totale è il numero totale di punti dati in tutti e quattro i quadranti. Questa formula fornisce una misura compresa tra 0 e 1, con 0,25 che corrisponde a nessuna preferenza comportamentale (Figure 1E e 2C, codice supplementare AttractionIndex.m).
5. Esegui 5-10 ripetizioni di ogni condizione sperimentale, utilizzando un nuovo gruppo di mosche per ogni ripetizione. Confronta gli indici di attrazione tra le condizioni o rispetto ai controlli utilizzando il test non parametrico di Kolmogorov-Smirnov (Figura 1F, funzione kstest2 in Matlab).

Risultati

Figura 1: Esempio di dati generati utilizzando un saggio olfattivo a quattro campi. (A) Schema dell'arena a quattro campi. (B) Le risposte neutre si osservano quando tutti e quattro i quadranti contengono solo perfusione di aria secca. (C) Risposte di attrazione a una diluizione del 6,25% dell'aceto di sidro di mele perfuso dal quadrante superiore sinistro. (D

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di erogazione dell'aria			(Quantità necessaria)
Tubi e connettori
Collettori termoplastici NPT(F)	Cole-Parmer, IL, Stati Uniti	R-31522-31	1
Nipplo riduttore esagonale (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5232T314	1
Tubi (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5108K43	50 piedi
Tubi (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 52355K41	100 piedi
Raccordi per tubi spinati	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5117K71	1 confezione
Raccordi per tubi push-to-connect	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5779K102	4
Raccordi per tubi spinati (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5463K439	1 confezione (10)
Raccordi per tubi spinati (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5463K438	Confezione da 2 (10)
Raccordi per tubi spinati (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5463K4	Confezione da 2 (10)
Raccordi per tubi spinati (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice: 5670K84	1
Tappo a testa esagonale	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice 48335K152	1
Regolatore di pressione dell'aria, filtro dell'aria e flussometri			(Quantità necessaria)
Unità di essiccazione di gas di laboratorio	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, STATI UNITI	Modello: L68-NP-303; stock #26840	1
Telai multitubo per tubi di flusso da 150 mm	Cole-Parmer, IL, Stati Uniti	R03215-30	1
Telai multitubo per tubi di flusso da 150 mm	Cole-Parmer, IL, Stati Uniti	R03215-76	1
Tubi di flusso da 150 mm	Cole-Parmer, IL, Stati Uniti	R-03217-15	9
Cartuccia della valvola	Cole-Parmer, IL, Stati Uniti	R-03218-72	9
Regolatore d'aria di precisione	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice 6162K13	1
Valvole Soleniod	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Controllore dell'elettrovalvola	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-gennaio	1
Contalitri elettronico	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) e un	Strumenti nazionali	NI USB-6009	1
alimentatore	Strumenti Extech	Telefono 382200	1
Camere degli odori
Barattolo in polipropilene a bocca larga 2 oz; 60 ml	Nalgene	Codice: 562118-0002	Ne sono necessari almeno 5 per esperimento, ma è necessaria una camera separata per ogni diluizione di ciascun odorante. Disponibile presso Container Store, parte #635114)
Camera degli odori in vetro, 0.25 oz	Bottiglia Sunburst	LB4B	Sono necessari almeno 5 per esperimento
Valvola "In" per camera odori	Smart Products, Inc., CA, Stati Uniti	Codice 214224PB-0011S000-4074	1 di queste parti viene utilizzata per camera degli odori, ma devono essere sostituite frequentemente
Valvola "Out" per camera odori	Smart Products, Inc., CA, Stati Uniti	Codice 224214PB-0011S000-4074	1 di queste parti viene utilizzata per camera degli odori, ma devono essere sostituite frequentemente
Anello circolare	RT Dygert International, MN, Stati Uniti	AS568-029 Buna-N O-R	1 confezione (100)
Vola nell'arena, nella telecamera e nelle scatole di comportamento			(Quantità necessaria)
Comportamento e materiale della scatola della fotocamera	Plastica interstatale, CA, Stati Uniti	ABS nero estruso (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 pollici quadrati
Teflon per arena di mosca e inserti per camere degli odori, spessore 3/8", 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice 8545K27	1
Lastre di vetro, 1/8" di spessore, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, Stati Uniti	Codice 8476K191	numero arabo
Controllore termoelettrico a doppia azione	WAtronix Inc, CA, Stati Uniti	DA12V-K-0	1
Array di LED IR	Illuminazione avanzata, Rochester, VT, Stati Uniti	AL4554-88024, PS24-TL	2 array di LED e un alimentatore
Condizionatore d'aria	Negozio Melcor	MAA280T-12	1
Sistema di imaging			(Quantità necessaria)
Obiettivo Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm f/1.4) C-mount	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, STATI UNITI	PEC21211 KP	1
Cavo di interconnessione CCXC-12P05N	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, STATI UNITI	SOCCXC12P05N	1
Adattatore per fotocamera DC-700	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, STATI UNITI	SODC700	1
Filtro IR B+W 40,5 093	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, STATI UNITI	Codice 65-072442	1
TiFFEN 40,5 mm Polarizzatore circolare	amazzone		1
Telecamera IR	Sorgente di visione industriale, FL, Stati Uniti	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
Convertitore video USB	La fonte di imaging, Carolina del Nord, Stati Uniti	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (software di tracciamento delle mosche)	Julian Brown, Stanford, California: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
Software di acquisizione IC	La fonte di imaging, Carolina del Nord, Stati Uniti	(http://www.theimagingsource.com/)
misto			(Quantità necessaria)
Utensile rotante Dremel	Dremel, Racine, WI, Stati Uniti	Dremel 8000-03	1
Punte diamantate per il taglio del vetro	Disponibile presso vari fornitori; MSC fornitura industriale Co, Melville, NY	90606328	1