drosofila Saggio del labirinto a Y: un metodo per valutare le risposte olfattive nelle mosche

In questo articolo

Abstract

Fonte: Simonnet, M. M., et al. Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay. J. Vis. Exp. (2014).

Questo video descrive un metodo per testare il comportamento esplorativo olfattivo nel moscerino della frutta, chiamato labirinto a Y. La clip del protocollo in primo piano mostra come impostare ed eseguire il test.

Protocollo

Questo testo del protocollo è un estratto da Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Prima di iniziare

Utilizzare un materiale di riferimento isogenizzato con fenotipi comportamentali stabili e robusti. Non esiste una regola generale per la scelta di questo stock, poiché tutti i potenziali controlli possono contenere alleli di fondo eterogenei.
Utilizzare questo ceppo di controllo per reincrociare ogni altro stock necessario per i passaggi successivi. Questa fase di reincrocio è tipicamente rappresentata da almeno 5 incroci successivi di una singola femmina vergine (per consentire un possibile cross-over tra cromosomi omologhi) a 2-3 maschi di riferimento isogenici. Questo passaggio è importante per omogeneizzare il background genetico tra i diversi stock di mosche.
Mantenere le scorte di Drosophila con farina di mais standard (9%), lievito (10%) e terreno di agar (1,5%) integrati con antibiotico (0,4% metil para-idrossi-benzoato) in un ciclo luce/buio di 12 ore a 25 °C.
Realizzare esperimenti chemiosensoriali in una stanza a temperatura controllata (25 °C) sotto luce rossa lontana (per eliminare il contributo di segnali visivi e concentrarsi sui segnali chemiosensoriali). Rinnovare regolarmente l'aria della stanza per ventilare l'area tra ogni esperimento.

2. Risposta olfattiva utilizzando un saggio del labirinto a Y

Far morire a fame le mosche per 16-18 ore a 25 °C in tubi di vetro contenenti tovagliolo di carta bagnato prima del test.
Unire un connettore a forma di Y a due fiale di vetro e a una fiala di plastica più piccola (fiala di caricamento). Utilizzare puntali per pipette da 1 ml che passano attraverso i tappi di schiuma per collegare il connettore alle tre fiale e ottenere un labirinto a Y ben sigillato. Tagliare le estremità strette di due puntali per pipette (~2 mm di diametro, per evitare qualsiasi ritorno della mosca una volta presa la sua decisione) per formare due fiale "trappola" e un'estremità grande di un puntale per pipetta per formare il tubo di "caricamento" (Figura 1A).
Appena prima di collegare le fiale "trappola" (Figura 1B), posizionare una carta da filtro di ~6 mm di diametro in ciascuna fiala. Aggiungere 40 μl di soluzione odorizzante su una carta da filtro e 40 μl del solvente corrispondente sulla seconda carta da filtro.
Introdurre dieci mosche di 4-9 giorni nella fiala di "caricamento". Non utilizzare l'anestesia CO₂ durante questo trasferimento, poiché ha un forte effetto sul comportamento. Piuttosto utilizzare un breve raffreddamento sul ghiaccio. Una corretta manipolazione delle mosche anestetizzate è importante per limitare il più possibile lo stress sui soggetti.
1. Eseguire una serie di test del labirinto a Y a 25 °C sotto luce rossa lontana (utilizzando lampadine a LED per limitare la possibile fonte di calore) per evitare il più possibile gli stimoli visivi. Fare attenzione ad alternare gli orientamenti dei labirinti a Y (tubo contenente odorante a sinistra, o a destra, e tubo di carico davanti o dietro; Figura 1C).
2. Attendere diverse ore affinché le mosche entrino nella fiala della trappola contenente l'odorizzante o il solvente. Il conteggio vola dopo 24 ore per aumentare la partecipazione fino a oltre l'80% e fornire il valore massimo dell'indice olfattivo (Simonnet, comunicazione personale).
3. Calcolare l'indice olfattivo risultante utilizzando la seguente formula: (numero nel tubo dell'odore - numero nel tubo del solvente)/numero totale di mosche caricate.
Lavare l'allestimento del labirinto a Y come segue: immergere l'allestimento smontato in RBS 35 MD per una notte. Risciacquare accuratamente con acqua di rubinetto. Infine risciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare.

3. Analisi statistica dei dati

Eseguire un t-test, un'ANOVA unidirezionale o un'ANOVA bidirezionale a seconda dei dati e delle variabili.

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Risultati

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Figura 1: Risposta olfattiva maschile valutata con un set-up a labirinto a Y. A) Dispositivo diviso. B) Dispositivo assemblato. C) Allestimento funzionante in condizioni di luce rossa lontana. D) Quantificazione delle risposte olfattive maschili nei confronti dell'acido acetico (AA) o dell'acido fenilacetico (PAA) entrambi diluiti in acqua distillata (10...