Questo protocollo è un estratto da Brust-Mascher e Scholey, Tecniche di microiniezione per studiare la mitosi nell'embrione sinciziale di Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2009).
Ricette:
Piatti di succo d'uva:
- 5,5 g di bacto agar
- 14,5 g di destrosio o glucosio
- 7,15 g di saccarosio
- 45 ml di succo d'uva concentrato (100% succo).
- 204,5 ml H20
- 625 μl di NaOH 10N
Mescola tutti gli ingredienti e cuoci nel microonde fino a ebollizione.
Aggiungere 2,8 ml di miscela acida (miscela acida: 20,9 ml di acido propionico, 2,1 ml di acido fosforico, 27 ml di H20)
Mescola e versa su piastre di Petri da 35 mm. Lasciate solidificare a temperatura ambiente per uno o due giorni. Se le piastre non verranno utilizzate a breve, sigillare con parafilm e mantenere a 4 °C (lasciare equilibrare a RT prima dell'uso).
Pasta di lievito:
Sciogliere circa un cucchiaino di lievito (Sigma YSC2, lievito di Saccharomyces cerevisiae tipo II) in acqua fino a formare una pasta densa. Mettine una piccola quantità su ogni piatto di succo d'uva appena prima dell'uso.
Buffer di iniezione:
- 150 mM di K-aspartato
- 10 mM di K-fosfato
- 20 mM di imidazolo, pH 7,2
Colla eptanica:
Srotolare il doppio nastro adesivo e metterlo in un flacone da 100 ml, aggiungere circa 50 ml di eptano, sigillare il flacone e agitare per diversi giorni. Quando si utilizza, aggiungere eptano se la colla è troppo densa.
Camera di disidratazione:
Prendi una piastra di Petri da 100 mm, metti una parte di una piastra da 35 mm all'interno per creare un "tavolo" e aggiungi la drierite (solfato di calcio anidro) intorno ad essa in modo che l'altezza della drierite non sia superiore al "tavolo" e al coperchio. Il vetrino coprioggetti con gli embrioni verrà posto su questo "tavolo" per la disidratazione prima dell'iniezione. È una buona idea usare almeno un po' di drierite indicante e cambiarla quando ha cambiato colore.
Protocollo:
Questo protocollo può essere utilizzato per l'iniezione di praticamente qualsiasi reagente solubile nell'embrione sinciziale di Drosophila: ad esempio, una proteina fluorescente per l'osservazione o un inibitore della proteina bersaglio o entrambi.
1. Raccolta di embrioni
- Metti un nuovo piatto di succo d'uva sulla gabbia di posa.
- Togliete questa targa dopo un'ora, questa è la prima raccolta della giornata e spesso non è molto buona. Può essere scartato.
- Cambia la piastra ogni ora per continuare a raccogliere gli embrioni per un'ora ciascuno.
2. Preparazione del vetrino coprioggetti
- Metti un vetrino coprioggetti 50 x 22 mm su un lato di un vetrino da microscopio. Fissa i quattro angoli al vetrino in modo che non si muova.
- Utilizzando un applicatore con punta di cotone, mettere uno strato di colla eptano in una linea sul vetrino coprioggetti (la colla non deve essere viscosa e deve asciugarsi in pochi secondi, altrimenti aggiungere altro eptano).
- Metti un pezzo di doppio nastro adesivo sul vetrino verso il lato del vetrino.
3. Preparazione dell'embrione
NOTA: Gli embrioni dovrebbero essere fotografati circa 2 ore dopo l'inizio della raccolta, quindi inizia i seguenti passaggi lasciando un tempo sufficiente per finirli entro questo lasso di tempo.
- Con un pennello inumidito, prelevare con cura gli embrioni dal piatto di succo d'uva e posizionarli su un doppio nastro adesivo sul vetrino.
- Usando la parte esterna delle pinzette, arrotolare gli embrioni sul doppio nastro adesivo fino a quando il corion (la membrana esterna) non si apre.
- Raccogli l'embrione facendolo rotolare delicatamente sul corion in modo che aderisca alla pinzetta e posizionalo sulla colla eptanica sul vetrino coprioggetti con il lato lungo dell'embrione parallelo al lato lungo del vetrino coprioggetti. Prepara da 10 a 20 embrioni in una fila.
- Rimuovere il vetrino coprioggetti e metterlo nella camera di disidratazione per 3-8 minuti (questo dipende dall'umidità della stanza e dalla quantità da iniettare).
- Posizionare su una camera metallica con grasso sottovuoto.
- Coprire gli embrioni con olio di alocarburi 700 per evitare un'ulteriore disidratazione. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione.
4. Iniezione di embrioni
- Trova gli embrioni con un obiettivo 16x.
- Allontana gli embrioni e trova l'ago senza spostare il piano focale.
- Centrare l'ago e spostarlo verso l'alto senza spostarlo in direzione x o y.
- Se l'ago non è aperto, posizionare il bordo del vetrino coprioggetti nel campo visivo, ma non dove sarà l'ago, e abbassare l'ago sullo stesso piano focale. Muovi con molta attenzione il vetrino coprioggetti finché non colpisce l'ago e lo rompe delicatamente. Se l'ago è aperto, andare al passaggio 5. (Gli aghi possono essere aperti con acido fluoridrico prima del riempimento).
- Metti gli embrioni in vista (ma non dove sarà l'ago), abbassa l'ago nell'olio e assicurati di ottenere delle belle gocce di liquido dall'ago.
- Sposta con attenzione ma costantemente l'embrione nell'ago e inietta una goccia nell'embrione e allontana l'embrione. (Oppure seguire le istruzioni del suo apparecchio per iniezione).
- Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, sono pronti per l'osservazione su un microscopio confocale.
