Saggio del punto luminoso: un metodo per studiare il comportamento fototattico della Drosophila

Abstract

Fonte: Sun, Y., et al. Saggio basato su punti luminosi per l'analisi della fototassi larvale di Drosophila. J. Vis. Exp. (2019).

Le larve di Drosophila sono sensibili alla luce e rispondono ai cambiamenti della luce circostante. Questo video descrive un test che verifica la loro capacità di evitare la luce, chiamato saggio del punto luminoso. Il protocollo presentato mostra come impostare il test con un LED a luce blu e mostra come registrare il comportamento dell'animale in risposta all'incontro con la luce.

Protocollo

Questo testo del protocollo è un estratto da Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Configurazione del sistema di imaging

1. Fissa una webcam ad alta risoluzione con una clip di ferro, a circa 10 cm sopra il punto luminoso sul desktop (Figura 1).
2. Regolare l'orientamento dell'obiettivo della fotocamera verso il desktop. Collegare la fotocamera a un computer tramite un'interfaccia USB.
3. Posiziona una piastra di agar sul desktop proprio sotto la fotocamera.
4. Apri il software "Amcap9.22" sul computer con Windows 7 e il punto luminoso verrà automaticamente visualizzato nella finestra di AMcap. Spostare leggermente la fotocamera a sinistra o a destra per assicurarsi che il punto luminoso sia vicino al centro della finestra. Assicurarsi che la fotocamera non ostruisca il percorso della luce. Il punto luce deve essere completo e rotondo.
   NOTA: Il software può essere trovato all'indirizzo http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fissare un filtro passa-banda da 850 nm ± 3 nm con una clip a 5-7 mm proprio sotto la fotocamera.
   NOTA: Il diametro del filtro è di circa 2,5 cm e l'obiettivo della fotocamera ha un diametro inferiore a 1 cm, quindi il filtro può coprire il campo visivo della fotocamera. Con il filtro sotto la fotocamera, il punto luminoso non dovrebbe essere visibile nella finestra di AMcap.
6. Posizionare tre LED che generano luce infrarossa (lunghezza d'onda centrale = 850 nm) in modo uniforme attorno alla piastra di agar. Ogni LED deve trovarsi a circa 5 cm di distanza dal bordo della piastra di agar e la superficie della lente del LED deve essere inclinata di 70° verso il basso verso la piastra di agar. Collegare i LED all'alimentazione tramite il convertitore CA-CC.
   NOTA: È meglio fissare le posizioni e gli angoli dei LED a luce infrarossa per garantire la coerenza della luminosità del campo in varie prove sperimentali e facilitare la successiva elaborazione video.
7. Metti una lavagna nera tra il computer e il dispositivo. Imposta la luminosità dello schermo del computer per evitare che la luce dello schermo del computer influisca sull'esperimento.
   NOTA: Mantenere l'ambiente buio quando si misura la lunghezza d'onda o l'intensità della luce.

2. Impostazione dei parametri di imaging

1. Nel menu del software AMcap, scegliere Opzioni | Dispositivo video | Formato di acquisizione e imposta la dimensione in pixel del video acquisito su 800 x 600 e la frequenza fotogrammi su 60 fps.
2. Rimuovere il filtro da sotto la telecamera, posizionare un righello sotto la telecamera e regolare la messa a fuoco della telecamera per rendere la linea di scala chiara e parallela alla larghezza del campo visivo video.
3. Fai clic su Acquisisci | Impostare | Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, fare clic su Avvia registrazione, registrare la distanza effettiva corrispondente a 600 pixel e calcolare il rapporto tra ciascun pixel e la distanza effettiva.

3. Registrazione video del comportamento di evitamento della luce

1. Mantenere una temperatura di 25,5 °C durante tutti gli esperimenti. Se necessario, controlla la temperatura ambiente con un condizionatore d'aria. Mantieni l'umidità costantemente al 60% con un umidificatore.
2. Effettuare un breve video della posizione del punto luminoso denominata "lightarea1". Quindi, spostare indietro il filtro da 850 nm ± 3 nm per coprire l'obiettivo della fotocamera.
   NOTA: Quando si registra il comportamento larvale, l'obiettivo della fotocamera è coperto dal filtro da 850 nm ± 3 nm in modo che il punto luminoso non venga mostrato nel video. Il punto luminoso può essere ricostruito in video con le larve in un secondo momento con Matlab. Non modificare la posizione della fotocamera ed evitare di modificare il rapporto tra ciascun pixel e la distanza effettiva misurata al punto 2.3.
3. Accendi una luce (cioè una luce della stanza) lontana dal dispositivo sperimentale. Abbassa la luce il più in basso possibile, purché le larve possano essere viste chiaramente con gli occhi. Togliete le larve dal terreno di coltura con un cucchiaio, raccogliete delicatamente una larva di terzo stadio e lavatela con acqua distillata. Fai attenzione a lavare le larve una alla volta per evitare interferenze dovute alla fame. Un singolo esperimento richiede almeno 20 larve.
4. Trasferire la larva al centro della piastra di agar posta sotto la telecamera durante il passaggio 1.3. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla larva con un pennello o utilizzare carta assorbente per rimuovere l'acqua dalla larva per evitare il riflesso della luce sotto la lente. Spegni la luce della stanza e lascia che la larva si acclimati per 2 minuti nell'ambiente buio.
5. Accendi la luce LED per generare luce infrarossa e spazzola delicatamente la larva al centro del piatto. Quando la larva inizia a strisciare dritta, ruota la piastra per far sì che la larva si diriga verso il punto luminoso. Assicurati che strisci dritto fin dall'inizio, altrimenti potrebbe non avere accesso al punto luminoso.
6. Fai clic su Acquisisci | Impostare | Acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio, quindi fare clic su Avvia registrazione per registrare. Lascia che la larva strisci verso il punto luminoso, entra nel punto luminoso, quindi lascia il punto luminoso fino a quando non è quasi fuori dal campo visivo. Fai clic su Interrompi registrazione. Se la larva si allontana dal punto luminoso prima di avvicinarsi, fare clic direttamente su Interrompi registrazione.
7. Allontanare il filtro dalla fotocamera. Gira un breve video della posizione del punto luminoso denominato "lightarea2" e confrontalo con "lightarea1" per assicurarti che la posizione del punto luminoso non venga modificata. Se si osserva un evidente cambiamento di posizione, eliminare i dati.

Risultati

Figura 1: Set-up sperimentale. (A) Rappresentazione schematica del set-up per il saggio di fototassi veloce larvale basato su punti luminosi. Le linee blu rappresentano i percorsi della luce visibile utilizzati come stimolazione visiva e le linee rosse rappresentano i percorsi della luce infrarossa. Le frecce indicano la direzione della luce. Il filtro passa-banda da 850 nm consente il passaggio della lu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LED che genera luce infrarossa da 850 nm ± 3 nm	Thorlabs, Stati Uniti	PM100A	Sensori compatibili: Fotodiodo e Termico Gamma di potenza otticaa: da 100 pW a 200 W Gamma di lunghezze d'onda del sensore disponibilia: 185 nm-25 μm Frequenza di aggiornamento del display: 20 Hz Larghezza di banda: DC-100 kHz Gamma del sensore a fotodiodob: 50 nA-5 mA Gamma del sensore a termopilab: 1 mV-1 V
Convertitore da CA a CC	Thorlabs, Stati Uniti	S120VC	Dimensione apertura: Ø9,5 mm Gamma di lunghezze d'onda: 200-1100 nm Gamma di potenza: 50 nW-50 mW Tipo di rivelatore: Fotodiodo Si (UV esteso) Linearità: ±0,5% Incertezza di misuraC: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
filtro passa-banda	Thorlabs, Stati Uniti	DC2100	Intervallo di corrente LED: 0-2 A Risoluzione corrente LED: 1 mA Precisione della corrente LED: ±20 mA Tensione diretta LED: 24 V Gamma di frequenza di modulazione: 0-100 kHz Onda sinusoidale Modulazione: Arbitraria
Luce blu a LED collimata	ELP, Cina	USBFHD01M	Risoluzione massima: 1920x1080 F6.0 mm Sensore: 1/2.7" CMOS OV2710
Console compatta del misuratore di potenza	Ocean Optics, Stati Uniti	USB2000+(RAD)	Dimensioni: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Peso: 190 g Rivelatore: Sony ILX511B (array CCD lineare al silicio a 2048 elementi) Gamma di lunghezze d'onda: 200-850 nm Tempo di integrazione: 1 ms – 65 secondi (20 secondi tipici) Gamma dinamica: 8,5 x 10^7 (sistema); 1300:1 per una singola acquisizione Rapporto segnale/rumore: 250:1 (segnale completo) Rumore scuro: 50 RMS conta Reticolo: 2 (250 – 800 nm) Fessura: SLIT-50 Lente di raccolta del rivelatore: L2 Smistamento degli ordini: OFLV-200-850 Risoluzione ottica: ~2,0 nm FWHM Luce diffusa: <0,05% a 600 nm; <0,10% a 435 nm Connettore in fibra ottica: fibra a filo singolo ad apertura numerica da SMA 905 a 0,22
Driver LED ad alta potenza	Minhongshi, Cina	MHS-48XY	Tensione di lavoro: DC12V Lunghezza d'onda centrale: 850nm
webcam ad alta risoluzione	Thorlabs, Stati Uniti	MWWHL4	Colore: Bianco caldo Temperatura di colore correlata: 3000 K Corrente di prova per la potenza tipica del LED: 1000 mA Corrente massima (CW): 1000 mA Larghezza di banda (FWHM): N/A Potenza elettrica: 3000 mW Angolo di visione (angolo completo): 120° Dimensioni dell'emettitore: 1 mm x 1 mm Durata tipica: >50 000 h Temperatura di esercizio (senza condensa): da 0 a 40 °C Temperatura di stoccaggio: da -40 a 70 °C Gruppi di rischio: RG1 – Gruppo a basso rischio
LED Bianco Caldo	Mega-9, Cina	BP850/22K	Ø25,4(+0~-0,1) mm Larghezza di banda: 22±3nm Trasmittanza di picco: 80% Lunghezza d'onda centrale: 850 nm±3 nm
spettrometro	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap è un'applicazione per l'acquisizione di immagini fisse e video con funzioni avanzate di anteprima e registrazione. Si tratta di un'applicazione desktop progettata per computer con Windows 7 SP1 o versioni successive. La maggior parte dei dispositivi compatibili con Video per Windows e DirectShow sono supportati, indipendentemente dal fatto che si tratti di webcam economiche o di schede di acquisizione video avanzate.
Sensore di potenza a fotodiodo standard	Super Dragon, Cina	YGY-122000	Ingresso: CA 100-240 V ~ 50 / 60 Hz 0,8 < > Uscita: DC 12V 2A
Sensore di potenza termica	Thorlabs, Stati Uniti	Codice: M470L3-C1	Colore: Blu Lunghezza d'onda nominalea: 470 nm Larghezza di banda (FWHM): 25 nm Corrente massima (CW): 1000 mA Tensione diretta: 3,2 V Potenza elettrica (max): 3200 mW Dimensioni dell'emettitore: 1 mm x 1 mm Durata tipica: 100 000 h Temperatura di esercizio (senza condensa): da 0 a 40 °C Temperatura di stoccaggio: da -40 a 70 °C Gruppo di rischiob: RG2 – Gruppo a rischio moderato
Sensore di potenza termica	Thorlabs, Stati Uniti	S401C	Gamma di lunghezze d'onda: 190 nm-20 μm Gamma di potenza ottica: 10 μW-1 W(3 Wb) Dimensione apertura in ingresso: Ø10 mm Area del rivelatore attivo: 10 mm x 10 mm Densità di potenza ottica massima: 500 W/cm2 (Media) Linearità: ±0,5%