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Articolo metodologico
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30 aprile 2023
Fonte: Imura, E., et al. Protocolli per la visualizzazione di organi steroidogenici e dei loro organi interattivi con immunocolorazione nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).
Questo video descrive la ghiandola ad anello di Drosophila, una complessa struttura endocrina importante per la biosintesi e la secrezione di ecdisteroidi e altri ormoni. Il protocollo presentato ne dimostra la dissezione, la fissazione e l'immunocolorazione.
Questo protocollo è un estratto da Imura et al., Protocolli per la visualizzazione di organi steroidogenici e dei loro organi interattivi con immunocolorazione nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1.
1. La dissezione della ghiandola dell'anello larvale (RG)
NOTA: In D. melanogaster, che appartiene ai Ditteri ciclorrafei, il PG si trova all'interno di un organo endocrino composi....
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Figura 1: Lo schema generale dei protocolli. Due metodi di dissezione distinti sono applicabili alle larve e alle femmine adulte, a seconda dello scopo degli esperimenti. Anche i metodi di montaggio sono studiati in base alle condizioni del campione. Le tecniche di fissazione, colorazione e imaging sono fondamentalmente comuni a tutti i campioni.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Raccolta degli ovuli | |||
| piatto per coltura tissutale (55 mm) | COME UNO | Codice 1-8549-02 | per piastre di agar succo d'uva |
| coppa di raccolta | HIKARI KAGAKU | ||
| pasta di lievito | Lievito secco orientale, Tokyo | ||
| 100% succo d'uva | Welch Food Inc. | ||
| larve di allevamento | |||
| flaconcini piccoli (12ml, 40×23,5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| passante monouso | COME UNO | 6-488-01 | |
| cibo standard per mosche | La ricetta è sul sito web del centro azionario di Bloomington. | ||
| dissezione | |||
| microscopio da dissezione | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| microscopio da dissezione | Leica | S8 AP0 | |
| piatto per coltura tissutale (35 x 10 mm, non trattato) | IWAKI | Codice 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting di silicone all'interno di piatti | |
| Ago Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | Un "coltello" per tagliare il tessuto |
| pinze, Inox, #5 | Dumont, Svizzera | ||
| Spilla per insetti (0,18 mm di diametro) | Marchio Shiga | per dissezione di filetti | |
| micro forbici | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fissazione | |||
| acqua ultrapura | Merck Millipore | ||
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | |||
| Formaldeide | Nacalai tesque | Codice: 16222-65 | |
| Paraformaldeide | Nacalai tesque | Codice 02890-45 | |
| Tritone-X100 | Nacalai tesque | Codice 35501-15 | |
| Microprovette (1,5 ml) | INA OPTIKA | Visualizzazione del materiale CF-0150 | |
| Incubazione | |||
| Come un miscelatore a swist TM-300 (a bilanciere) | Come uno | TM-300 | sedia a dondolo |
| Albumina sierica bovina | sigma | 9048-46-8 | |
| Anticorpi primari | |||
| anti-Sro (porcellino d'India), 1:1000 | |||
| anti-GFP (coniglio), 1:1000 | Sonde molecolari | Codice: A6455 | Shimada-Niwa e Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mAb di topo, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | Codice 04363-66 | |
| anti-5HT (coniglio), 1:500 | sigma | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Banca degli ibridomi per gli studi sullo sviluppo (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-caderina (ratto), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| Anti-NC82 (mouse), 1:50 | DSHB | NC82 | |
| Anticorpo secondario | |||
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, coniugato Alexa Fluor 488 | Tecnologie per la vita | A-11008 | |
| Anticorpo secondario anti-IgG (H+L) di capra, coniugato Alexa Fluor 488 | Tecnologie per la vita | A-11001 | |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-ratto di capra, coniugato Alexa Fluor 546 | Tecnologie per la vita | A-11081 | |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-porcellino d'India di capra, coniugato Alexa Fluor 555 | Tecnologie per la vita | Codice A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 falloidina coniugata con colorante | Tecnologie per la vita | Codice A-22283 | |
| Montaggio dei reagenti | |||
| Micro vetrino scorrevole | Matsunami Glass Ind., Ltd. | Visualizzazione del materiale SS7213 | |
| Vetro di copertura del microscopio quadrato | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C218181 | |
| Reagente FluorSave (reagente di montaggio) | Calbiochem | 345789 | |
| Pipetta di trasferimento 1 ml (contagocce monouso) | Watson | 5660-222-1S | |
| Azioni volanti | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP | doni da K. Ito, Università di Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) e Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
