Dissezione della ghiandola dell'anello larvale: isolamento degli organi endocrini in via di sviluppo da Drosophila

Abstract

Fonte: Imura, E., et al. Protocolli per la visualizzazione di organi steroidogenici e dei loro organi interattivi con immunocolorazione nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive la ghiandola ad anello di Drosophila, una complessa struttura endocrina importante per la biosintesi e la secrezione di ecdisteroidi e altri ormoni. Il protocollo presentato ne dimostra la dissezione, la fissazione e l'immunocolorazione.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Imura et al., Protocolli per la visualizzazione di organi steroidogenici e dei loro organi interattivi con immunocolorazione nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1.

1. La dissezione della ghiandola dell'anello larvale (RG)

NOTA: In D. melanogaster, che appartiene ai Ditteri ciclorrafei, il PG si trova all'interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola ad anello (RG, Figura 2D). Poiché non è possibile che il PG sia separato chirurgicamente da altri tipi di cellule (discusso più avanti), un obiettivo pratico è isolare un RG intatto e non danneggiato mediante dissezione.

1. Preparazione delle larve agli stadi di sviluppo appropriati
   NOTA: Per sincronizzare le fasi di sviluppo delle larve di D. melanogaster, è necessario raccogliere le uova entro una finestra temporale ristretta e raccogliere le larve nei momenti appropriati.
   1. Raccogliere le uova per 2 ore su una piastra di agar a 25 °C.
   2. Raccogli le larve di 1^° stadio appena nate sotto un microscopio da dissezione con una pinza e trasferiscile in una piccola fiala contenente purè di lievito standard / farina di mais><. NOTA: L'età delle larve è rappresentata da "ore dopo la deposizione delle uova (hAEL)", "ore dopo la schiusa (hAH)" o "ore dopo l'ecdisi L3 (hAL3E)".
   3. Al momento opportuno, raccogli le larve in scena con un anello di plastica usa e getta per evitare lesioni indesiderate. Per ridurre al minimo una differenza nella progressione dello sviluppo delle larve del 3^{° stadio}, raccogliere le larve del 2^° stadio a 70 hAEL (48 hAH) e lasciarle mutare a intervalli di 2 ore. Quindi, raccogliere le larve del 3^° stadio entro 2 ore dall'ecdisi L3; questa procedura dà 0-2 larve di hAL3E.
   4. Trasferire le larve in stadi in un piatto riempito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   5. Sciacquare le larve con PBS per rimuovere il cibo residuo dal corpo.
2. Dissezione grossolana di larve al microscopio da dissezione
   1. Tenere il gancio per la bocca di una larva con una pinza. Recidere il corpo larvale al terzo anteriore della lunghezza del corpo usando le micro forbici.
   2. Tenere l'estremità tagliata del corpo larvale anteriore con un paio di pinze. Usando l'altro paio di pinze, spingi delicatamente la punta della testa verso l'interno del corpo; Questa procedura capovolge il corpo larvale.
      NOTA: Questo passaggio può essere saltato per la dissezione di larve di 1^° stadio.
   3. Ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.2 con altre larve per 5-10 min.
      NOTA: Il numero di larve dovrebbe essere uguale o inferiore a 20 per risparmiare tempo per la dissezione.
3. Fissazione e colorazione dei tessuti con immunoistochimica
   1. Inserire il terzo anteriore dei corpi larvali (passaggio 1.2.2) in una microprovetta da 1,5 mL riempita con 500 μL di soluzione fix (paraformaldeide al 4% in PBS). Fissare meno di 20 campioni contemporaneamente, altrimenti il PBS attaccato ai campioni fissati può causare una diluizione sfavorevole del fissativo. Per la dissezione del raccordo, rimuovere una goccia di PBS e quindi aggiungere una goccia di fix solution.
      NOTA: Per la soluzione fissa, è possibile utilizzare formaldeide al 3,7% o paraformaldeide al 4%.
   2. Incubare i tessuti sezionati nella soluzione fissa per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) o in alternativa per 2 ore a 4 °C.
   3. Sostituire la soluzione fissa con 500 μl di PBS e risciacquare rapidamente i campioni 3 volte. Lavare i campioni con 500 μl di PBT allo 0,3% (PBS + 0,3% ottilfenolo etossilato) per 15 minuti su un bilanciere a RT. Per la dissezione del raccordo, rimuovere i perni degli insetti e trasferire i campioni in una microprovetta da 1,5 mL.
      NOTA: Per aumentare la permeabilità degli anticorpi nei tessuti, i campioni vengono trattati con 500 μL di PBT al 2,0% per 1-2 ore su un bilanciere a RT.
   4. Sostituire il PBT con 500 μL di soluzione bloccante (2% di albumina sierica bovina in PBT). Incubare i campioni per 1,5 ore su un bilanciere a RT.
   5. Sostituire la soluzione bloccante con 50 μl della soluzione anticorpale primaria, cioè anticorpi diluiti nella soluzione bloccante.
   6. Incubare i campioni per una notte su un bilanciere a 4 °C.
   7. Sostituire la soluzione di anticorpi primari con 500 μl di PBT allo 0,3% e risciacquare rapidamente i campioni 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 μl di PBT allo 0,3% per 15 minuti ciascuno su un bilanciere a RT.
   8. Sostituire lo 0,3% di PBT con 50 μL della soluzione di anticorpi secondari (anticorpi coniugati con colorante diluiti nella soluzione bloccante). Per la colorazione nucleare, 0,5 μL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,1 mg/mL di soluzione madre) vengono aggiunti a 50 μL. Incubare i campioni su un bilanciere per 2 ore a RT o in alternativa a 4 °C durante la notte.
      NOTA: Mantieni i campioni al buio.
   9. Sostituire la soluzione anticorpale con 500 μL di PBT allo 0,3% e risciacquare 5 volte. Lavare i campioni 3 volte con 500 μL 0,3% PBT per 15 minuti ciascuno a RT.
4. Dissezione fine del complesso cervello-RG contenente il PG e il montaggio
   1. Utilizzare una pipetta monouso per trasferire i campioni immunocolorati in una piastra riempita con PBT.
      allo 0,3% NOTA: Per evitare scomode bolle durante la dissezione e il montaggio, lo 0,3% di PBT può essere sostituito con PBS.
   2. Sotto un microscopio da dissezione, tenere la cuticola o il gancio della bocca con un paio di pinze. Utilizzando un ago da 27 G collegato a una siringa da 1 ml come "coltello", tagliare la punta anteriore dell'esofago e i dischi oculari per rimuovere il complesso cervello-RG-disco oculare dalla cuticola del corpo.
   3. Separare l'esofago e l'intestino dal complesso cervello-RG-disco oculare con una pinza. Poiché l'esofago passa attraverso il cervello sopra il cordone nervoso ventrale (VNC), estrarre l'intestino verso il lato posteriore><. NOTA: Per rimuovere i dischi immaginali extra dai campioni, tagliare le connessioni tra il cervello, i dischi oculari e i dischi delle gambe con un coltello ad ago.
   4. Ripetere i passaggi 1.4.1-1.4.4 per altri campioni.
      NOTA: Per evitare che i detriti tissutali si attacchino ai campioni, trasferire ogni campione completato in un piatto pulito diverso riempito con PBT o PBS allo 0,3%.
   5. Trasferire i campioni al centro di un vetrino pulito con una micropipetta.
      NOTA: Per le larve di 2° o 3° stadio, l'estremità della punta di una micropipetta deve essere troncata con una lama di rasoio.
   6. Sotto un microscopio da dissezione, allineare i singoli campioni con il lato dorsale rivolto verso l'alto utilizzando una pinza.
      NOTA: L'RG si trova sul lato dorsale del cervello (Figura 2A). Questo allineamento facilita la specifica dei singoli campioni durante l'imaging.
   7. Inclinare un vetrino e rimuovere quanto più PBT in eccesso possibile. Mettere una goccia di reagente di montaggio su un lato del vetrino. Posizionare il bordo di un vetrino coprioggetti dall'altro lato della goccia e applicare lentamente il vetrino coprioggetti sui campioni con una pinza.
      NOTA: Questa procedura impedisce che i campioni si spostino al di fuori del vetrino coprioggetto.
   8. Conservare i campioni a 4 °C. Conservare i campioni al buio.

Risultati

Figura 1: Lo schema generale dei protocolli. Due metodi di dissezione distinti sono applicabili alle larve e alle femmine adulte, a seconda dello scopo degli esperimenti. Anche i metodi di montaggio sono studiati in base alle condizioni del campione. Le tecniche di fissazione, colorazione e imaging sono fondamentalmente comuni a tutti i campioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Raccolta degli ovuli
piatto per coltura tissutale (55 mm)	COME UNO	Codice 1-8549-02	per piastre di agar succo d'uva
coppa di raccolta	HIKARI KAGAKU
pasta di lievito	Lievito secco orientale, Tokyo
100% succo d'uva	Welch Food Inc.
larve di allevamento
flaconcini piccoli (12ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
passante monouso	COME UNO	6-488-01
cibo standard per mosche			La ricetta è sul sito web del centro azionario di Bloomington.
dissezione
microscopio da dissezione	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
microscopio da dissezione	Leica	S8 AP0
piatto per coltura tissutale (35 x 10 mm, non trattato)	IWAKI	Codice 1000-035
Sylgard	TORAY		coarting di silicone all'interno di piatti
Ago Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Un "coltello" per tagliare il tessuto
pinze, Inox, #5	Dumont, Svizzera
Spilla per insetti (0,18 mm di diametro)	Marchio Shiga		per dissezione di filetti
micro forbici	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fissazione
acqua ultrapura	Merck Millipore
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
Formaldeide	Nacalai tesque	Codice: 16222-65
Paraformaldeide	Nacalai tesque	Codice 02890-45
Tritone-X100	Nacalai tesque	Codice 35501-15
Microprovette (1,5 ml)	INA OPTIKA	Visualizzazione del materiale CF-0150
Incubazione
Come un miscelatore a swist TM-300 (a bilanciere)	Come uno	TM-300	sedia a dondolo
Albumina sierica bovina	sigma	9048-46-8
Anticorpi primari
anti-Sro (porcellino d'India), 1:1000
anti-GFP (coniglio), 1:1000	Sonde molecolari	Codice: A6455	Shimada-Niwa e Niwa, 2014
anti-GFP (mAb di topo, GF200), 1:100	Nakarai tesque	Codice 04363-66
anti-5HT (coniglio), 1:500	sigma	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Banca degli ibridomi per gli studi sullo sviluppo (DSHB)	1B1
anti-DE-caderina (ratto), 1:20	DSHB	DCAD2
Anti-NC82 (mouse), 1:50	DSHB	NC82
Anticorpo secondario
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, coniugato Alexa Fluor 488	Tecnologie per la vita	A-11008
Anticorpo secondario anti-IgG (H+L) di capra, coniugato Alexa Fluor 488	Tecnologie per la vita	A-11001
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-ratto di capra, coniugato Alexa Fluor 546	Tecnologie per la vita	A-11081
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-porcellino d'India di capra, coniugato Alexa Fluor 555	Tecnologie per la vita	Codice A-21435
Alexa Fluor 546 falloidina coniugata con colorante	Tecnologie per la vita	Codice A-22283
Montaggio dei reagenti
Micro vetrino scorrevole	Matsunami Glass Ind., Ltd.	Visualizzazione del materiale SS7213
Vetro di copertura del microscopio quadrato	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C218181
Reagente FluorSave (reagente di montaggio)	Calbiochem	345789
Pipetta di trasferimento 1 ml (contagocce monouso)	Watson	5660-222-1S
Azioni volanti
w; GMR45C06-GAL4			dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP			doni da K. Ito, Università di Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) e Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)