Questo protocollo è un estratto da Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Saggio della sonda termica locale
Forniamo uno stimolo termico nocivo a un singolo segmento di corpo larvale utilizzando una sonda termica costruita su misura prodotta da Pro-Dev Engineering (vedi Tabella dei materiali). Sebbene questa sonda abbia caratteristiche di progettazione ottimali (una piccola punta metallica di ~ 0,07 mm2 area e la capacità di mantenere con precisione una temperatura di set point da 23 °C a 65 °C), in linea di principio dovrebbe essere sufficiente qualsiasi utensile con una punta piccola che può essere riscaldata a una temperatura definita per un periodo fino a 20 secondi. La punta della sonda viene utilizzata per stimolare le larve precoci del terzo stadio precisamente sulla linea mediana dorsale al segmento addominale A4 (vedi Figura 1). In risposta a questo stimolo termico, le larve mostreranno generalmente un comportamento di ritiro avversivo di rotolamento laterale di 360 gradi o più. Questo comportamento è distinto dalla loro risposta al tocco leggero a una sonda metallica a temperatura ambiente non nociva, che generalmente comporta una breve pausa nella loro attività locomotoria.
Protocollo per il test della sonda termica:
- Temperatura preimpostata della sonda termica al set point desiderato.
- Usa un pennello o una pinza per trasferire delicatamente una singola larva su una piattaforma piatta (di solito usiamo un piccolo pezzo di vinile tagliato da un legante) su cui le larve verranno successivamente stimolate. La larva deve essere coperta da un sottile film d'acqua prima del contatto con la sonda termica. Il velo d'acqua che copre la larva deve essere il meno possibile e coprire completamente la larva, assicurandosi che la larva non sia asciutta quando tocca il vinile.
- Premere delicatamente la punta della sonda contro la larva al segmento A4 applicando una leggera pressione con la punta a un angolo di circa 45° tra la sonda e la superficie della larva (vedi Figura 1). La pressione dovrebbe causare una leggera rientranza sulla superficie della larva e di solito sarà sufficiente per impedire la locomozione. Se la larva continua a muoversi, applica una pressione leggermente maggiore e di solito si fermerà. Non registrare i dati delle larve che si spostano oltre il campo visivo o per le quali non è possibile ottenere un contatto costante con la sonda fino alla risposta o al cutoff di 20 s.
- Continuare a stimolare la larva fino a quando non viene mostrata una risposta di ritiro o fino al raggiungimento del limite di 20 secondi, a seconda di quale evento si verifichi per primo. Le larve che rispondono in genere mostrano prima un comportamento preliminare di sollevamento della testa e della coda. Questo è solitamente seguito dal comportamento di ritiro di rotolamento di almeno 360 gradi. Solo un rollio completo di 360 gradi viene valutato come comportamento nocifensivo (il sollevamento preliminare della testa o della coda non lo è).
- Una volta avviato il comportamento di prelievo, rilasciare il contatto con la sonda e registrare la latenza o il tempo di prelievo. Se non si osserva alcun comportamento di astinenza entro 20 secondi, la larva non risponde. I risponditori possono essere ulteriormente suddivisi in 2 categorie. Se il comportamento di astinenza viene mostrato entro 5 secondi, allora la larva è una risposta rapida. Se il comportamento di astinenza viene mostrato tra 5-20 secondi, allora la larva è un reattore lento (vedi Figura 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
