Questo protocollo è un estratto da Liu et al. Un saggio del gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila, J. Vis. Exp. (2018).
1. Configurazione del gradiente di temperatura
- Preparare il gradiente unidirezionale
- Per creare un ambiente umido durante i saggi, posizionare i due blocchi di alluminio collegati a due bagni d'acqua su tovaglioli di carta bagnati, separati da 10 cm (Figura 1A).
- Accendere i due bagni d'acqua ~2 ore prima di iniziare il test per consentire un tempo sufficiente affinché la temperatura dei blocchi di alluminio si equilibri.
NOTA: Si consiglia di eseguire un esperimento simulato per determinare la temperatura di ciascun bagno d'acqua necessaria per ottenere il gradiente di temperatura lineare desiderato. Alcune coppie di temperature tipiche per impostare i bagni d'acqua sono elencate nella Tabella 1. Tuttavia, si noti che le temperature superficiali sono influenzate dalla temperatura ambiente. Anche la lunghezza dei tubi influisce sulle temperature in quanto c'è raffreddamento nei tubi. La lunghezza del tubo nella nostra configurazione è di 1,5 m.
- Microonde 100 mL di agarosio all'1% ad alta potenza in un flacone rotondo a bocca larga da 500 mL e versare 25 mL/piastra di saggio su un banco di lavoro piano. Preparare due piastre di analisi, che possono essere posizionate contemporaneamente sui blocchi di alluminio (Figura 1A).
- Dopo che l'agarosio si è solidificato (10-20 minuti), strofinare delicatamente ogni superficie di agarosio con una spugna da cucina standard o una spugna di melamina per rendere la superficie dell'agarosio leggermente ruvida, in modo che quando si spruzza acqua sul gel di agarosio, si crei una membrana d'acqua liscia e sottile e non si formino goccioline d'acqua.
- Immergere completamente le piastre in un contenitore con acqua distillata fino a quando il test non è pronto per essere eseguito per evitare che le piastre si secchino.
- Preparare un gradiente bidirezionale (facoltativo)
- Per creare un ambiente umido durante i saggi, posizionare tre blocchi di alluminio a 8 cm di distanza l'uno dall'altro (Figura 1B) su tovaglioli di carta bagnati.
- Accendere i due bagni d'acqua ~2 ore prima di iniziare il test per consentire un tempo sufficiente affinché la temperatura dei blocchi di alluminio si equilibri.
NOTA: Si consiglia di eseguire un esperimento simulato per determinare la temperatura di ciascun bagno d'acqua per il gradiente bidirezionale. Alcune coppie di temperature tipiche per impostare i bagni d'acqua sono elencate nella Tabella 2. Tuttavia, si noti che le temperature superficiali sono influenzate dalla temperatura ambiente. Anche la lunghezza dei tubi influisce sulle temperature in quanto c'è raffreddamento nei tubi. La lunghezza del tubo nella nostra configurazione è di 1,5 m.
- Per evitare che l'agarosio fuoriesca dalla piastra, avvolgere i bordi della lastra di alluminio con nastro adesivo per formare una parete alta 10 mm (Figura 1B).
- Utilizzando l'impostazione ad alta potenza, microonde 200 mL di agarosio all'1% in un flacone rotondo a bocca larga da 500 mL e versare 120 mL su una piastra di analisi.
- Dopo che l'agarosio si è solidificato (~30 min), strofinare delicatamente ogni superficie di agarosio con una spugna da cucina standard o una spugna di melamina per rendere la superficie dell'agarosio leggermente ruvida, in modo che quando si spruzza acqua sul gel di agarosio, si crei una membrana d'acqua liscia e sottile e non si formino goccioline d'acqua.
- Immergere completamente le piastre del saggio in un contenitore con acqua distillata fino a quando il test non è pronto per essere eseguito per evitare che si secchino.
- Impostare la sfumatura unidirezionale
- Preparare i reagenti e gli oggetti su un banco accanto all'apparato di saggiatura in gradiente (vedere la Tabella dei materiali).
- Per favorire un trasferimento efficiente della temperatura, riempire eventuali spazi tra i blocchi di alluminio e le piastre di analisi spruzzando acqua all'interfaccia tra i blocchi e la piastra.
- Utilizzando i guanti, rimuovere le piastre di analisi dal contenitore dell'acqua. Se l'acqua penetra tra il gel di agarosio e la piastra e provoca la formazione di protuberanze sulla superficie, rimuovere l'acqua con una micropipetta P1000.
- Posizionare le piastre di analisi sui blocchi di alluminio in modo che le demarcazioni che si trovano a 2 cm da entrambi i bordi corrispondano esattamente ai bordi dei blocchi di alluminio (Figura 1A,C).
- Spruzzare acqua sulla superficie della piastra (è sufficiente una sottile membrana d'acqua che copra la superficie dell'agarosio) per evitare che il gel di agarosio si secchi. Assicurati che la membrana dell'acqua sia continua e priva di goccioline d'acqua poiché le larve possono rimanere intrappolate nelle goccioline d'acqua.
- Copri il sistema a gradiente con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione dell'acqua e aiutare a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere 5-10 minuti per consentire alla temperatura di stabilizzarsi.
- Controllare la temperatura superficiale in 12 punti della piastra (Figura 1C). Effettuare due misurazioni all'interno di ciascuna zona per stabilire se c'è variabilità o meno all'interno di una zona. Assicurarsi che la temperatura in entrambi i punti sia compresa tra ± 0,2 °C della temperatura desiderata.
NOTA: La variabilità all'interno di una zona di solito si verifica perché le distanze esatte dei due punti dal bordo dei blocchi di alluminio non sono identiche. Regolare la posizione della piastra sui blocchi di alluminio per assicurarsi che le demarcazioni che si trovano a 2 cm da entrambi i bordi corrispondano esattamente ai bordi dei blocchi di alluminio.
- Se il gradiente di temperatura misurato si discosta dal gradiente desiderato, aumentare o diminuire l'impostazione della temperatura del bagno d'acqua e ricontrollare la temperatura superficiale dopo che la temperatura del bagno d'acqua si è stabilizzata/e.
- Coprire il sistema a gradiente con una scatola di cartone fino all'inizio del saggio.
- Impostare il gradiente bidirezionale (opzionale)
- Preparare i reagenti e gli oggetti su un banco accanto all'apparato di saggiatura in gradiente (vedere la Tabella dei materiali).
- Spruzzare acqua sulle superfici dei tre blocchi di alluminio per favorire un efficiente trasferimento della temperatura dai blocchi di alluminio alle piastre di analisi, riempiendo gli spazi tra le superfici.
- Rimuovere con cautela le piastre di analisi dal contenitore dell'acqua e posizionarle sui blocchi di alluminio. Se l'acqua penetra tra il gel di agarosio e la piastra, causando la formazione di protuberanze sulla superficie, rimuovere l'acqua con una micropipetta P1000.
- Posizionare la piastra di analisi sui blocchi di alluminio in modo che le linee mediane della prima e dell'ultima zona da entrambi i bordi corrispondano esattamente ai bordi dei due blocchi di alluminio laterali (Figura 1B,D).
- Spruzzare acqua sulla superficie della piastra (è sufficiente una sottile membrana d'acqua che copra la superficie dell'agarosio) per evitare che il gel di agarosio si secchi. Assicurati che la membrana dell'acqua sia continua e priva di goccioline d'acqua, poiché le larve possono rimanere intrappolate nelle goccioline d'acqua.
- Copri il sistema a gradiente con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione dell'acqua e aiutare a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere 5-10 minuti per consentire alla temperatura di stabilizzarsi.
- Controllare la temperatura superficiale in due punti lungo la linea mediana di ciascuna delle 10 zone (Figura 1D). Effettuare due misurazioni all'interno di ciascuna zona per stabilire se c'è variabilità o meno all'interno di una zona. Assicurarsi che la temperatura in entrambi i punti sia compresa tra ± 0,2 °C della temperatura desiderata.
NOTA: La variabilità all'interno di una zona di solito si verifica perché le distanze esatte dei due punti dal bordo dei blocchi di alluminio non sono identiche. Regolare la posizione della piastra sui blocchi di alluminio per assicurarsi che le linee mediane della prima e dell'ultima zona più vicine a ciascun bordo corrispondano esattamente ai bordi dei due blocchi laterali di alluminio.
- Se il gradiente di temperatura misurato si discosta dal gradiente desiderato, regolare le impostazioni della temperatura del bagno d'acqua e ricontrollare la temperatura della superficie dopo che la temperatura del bagno d'acqua si è stabilizzata/e.
- Coprire i blocchi con una scatola di cartone fino all'inizio del saggio.
2. Saggio e calcolo
- Rimuovere la scatola di cartone e controllare la temperatura superficiale del gel immediatamente prima di trasferire le larve sulla piastra. Ridurre al minimo il tempo di apertura della scatola di cartone per evitare di interrompere l'equilibrio della temperatura. Se la superficie è asciutta, spruzzare una piccola quantità d'acqua sulla superficie.
- Distribuire 150 ± 50 larve vicino al centro di ogni piastra (tra le zone 3 e 4 delle 6 zone) per il gradiente unidirezionale (zona di rilascio; Figura 1C).
NOTA: Per il gradiente bidirezionale, distribuire 200-400 larve lungo la zona centrale di ciascuna metà (Figura 1D).
- Posizionare un coperchio per micropiastre su ciascuna piastra di analisi per evitare che le larve striscino fuori. Coprire l'allestimento con una scatola di cartone per evitare l'esposizione alla luce, che potrebbe influire sulla scelta delle larve sul gel di agarosio.
NOTA: Per il gradiente bidirezionale, non dovrebbe essere necessario coprire il piatto con un coperchio, perché il piatto è più grande e la temperatura preferita delle larve è nella zona centrale. Di conseguenza, poche larve si accumulano ai bordi e hanno l'opportunità di strisciare fuori.
- Lasciare procedere il saggio per 10-30 minuti per il gradiente monodirezionale e per 15-35 minuti per il gradiente bidirezionale, a seconda dell'età delle larve (Tabella 3).
- Rimuovere la scatola di cartone e il coperchio della micropiastra. Fotografa le lastre dall'alto utilizzando una fotocamera digitale. Scattare due fotografie di ciascuna piastra di analisi in modo che lo sperimentatore possa scegliere quella con il contrasto e la luminosità migliori per l'analisi.
- Rimuovere tutte le larve dalle piastre di analisi e da qualsiasi punto al di fuori delle piastre mediante aspirazione.
- Pulire accuratamente le piastre del test, le provette e il filtro cellulare con acqua distillata. Riutilizzare le piastre di analisi preparate quel giorno, a meno che la superficie dell'agarosio non sia danneggiata.
- Calcola la distribuzione percentuale delle larve in ogni zona.
- Aprire l'immagine fotografica dei risultati del test utilizzando qualsiasi software che consenta di aggiungere marcature all'immagine. Per indicare le zone di analisi, tracciare linee verticali ogni 2 cm in base alle demarcazioni sulla piastra di analisi.
- Conta il numero di larve in ogni zona e registra i numeri. Non contare le larve nelle regioni a 0,5 cm da nessuna delle pareti. Il gel è più denso vicino alle pareti e le temperature superficiali non sono lineari in queste regioni.
- Per la pendenza unidirezionale, calcolare la distribuzione percentuale in ciascuna zona come segue:
(numero di larve in una data zona di 2 cm)/ (numero totale di larve in 6 zone) x 100.
- Per il gradiente bidirezionale, calcolare la distribuzione percentuale in ciascuna zona come segue:
(numero di larve in una data zona di 2 cm)/ (numero totale di larve in 5 zone su ciascun lato del gradiente) x 100.
