Questo protocollo è un estratto da Chiu et al., Assay Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis.(2010).
1. Caricamento delle mosche nei tubi di attività e nel sistema di monitoraggio dell'attività locomotoria
- Prima di caricare le mosche nei tubi di attività, accendere le incubatrici che verranno utilizzate per ospitare i monitor di attività. Regolare la temperatura utilizzando i comandi dell'incubatrice e impostare il regime luce/buio utilizzando il controller di luce del sistema DAM OPPURE il sistema di controllo della luce dell'incubatrice in base al progetto sperimentale desiderato. Il tempo necessario per caricare le mosche nei tubi di attività dovrebbe essere sufficiente per stabilizzare la temperatura.
- Anestetizzare le mosche con anidride carbonica.
- Usa un pennello fine per trasferire delicatamente una singola mosca in un tubo di attività.
- Afferra il centro di un singolo pezzo di filo che è di circa mezzo pollice con una pinza fine e inserisci il filo nell'estremità non alimentare del tubo di attività per tappare l'apertura e impedire alla mosca di fuoriuscire durante l'esperimento, consentendo allo stesso tempo il flusso d'aria nel tubo. In alternativa, per chiudere l'apertura è possibile utilizzare tappi di plastica con piccoli fori (Trikinetics, Inc.).
- Assicurati che i tubi siano appoggiati su un lato fino a quando la mosca non si sveglia, altrimenti c'è il rischio che la mosca si attacchi al cibo.
- Inserire i tubi nei monitor di attività. Con il modello più recente e compatto dei monitor Trikinetics (Trikinetics DAM2 e DAM2-7), è necessario tenere i tubi in posizione con elastici per garantire che il raggio infrarosso passi il tubo in posizione centrale.
- Inserire i monitor di attività nelle incubatrici e collegarli al sistema di raccolta dati tramite i cavi telefonici. Verificare utilizzando il software di raccolta del sistema DAM per assicurarsi che tutti i monitor siano collegati correttamente e che i dati vengano raccolti da ciascuno di essi. Il monitor emette un raggio di luce infrarossa attraverso il centro di ciascun tubo di attività in vetro. L'attività locomotoria dei moscerini viene registrata come dati binari grezzi, dove "uno" viene registrato ogni volta che il raggio infrarosso viene interrotto o viene registrato uno "zero" in cui il raggio infrarosso non viene interrotto.
2. Disegno sperimentale per registrare i dati per la determinazione della periodicità e dell'ampiezza circadiana
- Le mosche vengono sincronizzate e trascinate esponendole al regime di luce/buio (LD) e di temperatura desiderato per 2-5 giorni interi. La condizione di trascinamento più comunemente utilizzata è un ciclo luce/buio di 12 ore di luce/ 12 ore di buio (12:12 LD) a 25 °C. Questa condizione standard generalmente accettata si basa essenzialmente sul pensiero che la Drosophila abbia avuto origine da luoghi afro-equatoriali. Quando si studiano i ritmi circadiani c'è una fraseologia con cui è necessario familiarizzare. Rilevante per questo protocollo, l'ora in cui le luci si accendono nell'incubatrice è definita come tempo zeitgeber 0 (ZT0) e tutti gli altri orari sono relativi a quel valore (ad esempio, in un ciclo LD 12:12, ZT12 è l'ora in cui le luci vengono spente). In condizioni standard di LD 12:12, la Drosophila melanogaster wild type mostra tipicamente due periodi di attività; uno centrato intorno a ZT0 chiamato picco "mattutino" e un altro intorno a ZT12 chiamato picco "serale" (Figura 1A). Gli attacchi mattutini e serali sono controllati dall'orologio endogeno, ma ci sono anche risposte di "spavento" che sono esplosioni transitorie di attività in risposta alle transizioni luce/buio. Due giorni di trascinamento sono il minimo e potrebbero essere utilizzati, ad esempio, in schermi di grandi dimensioni che richiedono più tempo e sono orientati a misurare i periodi di funzionamento libero in condizioni di oscurità costante (vedi sotto, passaggio 2). Tuttavia, se si è interessati a studiare i modelli di attività durante un ciclo giornaliero luce-buio, è preferibile mantenere le mosche per 4-5 giorni in LD in modo da ottenere più dati. In sostanza, l'aumento del numero di mosche o del numero di giorni di LD nell'analisi finale dei dati (ad esempio, i dati aggregati degli ultimi due giorni di attività locomotoria LD) genererà profili e misurazioni dell'attività diurna più affidabili (ad esempio, la tempistica del picco mattutino o serale). Inoltre, la distribuzione giornaliera dell'attività varia in funzione della lunghezza del giorno (fotoperiodo) e della temperatura. Una delle ragioni principali per modificare il fotoperiodo o la temperatura rispetto allo standard è se si volesse studiare come i modelli di attività quotidiana subiscono l'adattamento stagionale (ad esempio Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). La Drosophila può anche essere trascinata a cicli di temperatura giornalieri (ad esempio Glaser e Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). I cicli di temperatura che variano di soli 2-3 °C sono sufficienti per trascinare i ritmi di attività.
- I ritmi dell'attività locomotoria di corsa libera vengono misurati in condizioni di buio e temperatura costanti dopo la fine del periodo di allenamento (vedi sopra, passaggio 1). L'impostazione del ciclo di luce può essere modificata in qualsiasi momento nella fase di buio dell'ultimo giorno di LD in modo tale che il giorno successivo dell'esperimento rappresenti il primo giorno di DD. Sette giorni di raccolta dei dati DD sono sufficienti per calcolare il periodo circadiano e l'ampiezza (ad esempio, la potenza o la forza del ritmo) delle mosche. In generale, è necessaria una dimensione del campione di almeno 16 mosche per ottenere periodi di corsa libera affidabili per un particolare genotipo. Anche se si è interessati solo a misurare l'attività diurna, è comunque meglio misurare i periodi di corsa libera delle mosche in DD poiché i cambiamenti nel periodo endogeno possono alterare la distribuzione giornaliera dell'attività in LD. Ad esempio, i moscerini con lunghi periodi endogeni di solito mostrano picchi serali ritardati nella LD (ad esempio, vedi Figura 2).
- Alla conclusione dell'esperimento, i dati binari grezzi raccolti utilizzando il software DAM System vengono scaricati su un dispositivo di archiviazione dati portatile, ad esempio una chiave USB.
- I dati binari grezzi vengono elaborati utilizzando DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) e sommati in contenitori da 15 e 30 minuti quando si analizzano i parametri circadiani o in contenitori da 1 a 5 minuti quando si analizzano i parametri di sonno/riposo. Attualmente, cinque minuti contigui di inattività è la definizione standard di sonno/riposo in Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho e Sehgal, Metodi enzimatici., (2005)).
- Esistono molti modi diversi per analizzare i dati raccolti sul sistema DAM, ma forniremo solo i metodi utilizzati abitualmente nel nostro laboratorio. Microsoft Excel viene utilizzato per assegnare il genotipo a diversi gruppi di campioni. Software FaasX (M. Boudinot e F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francia) o Insomniac (programma basato su Matlab; Leslie Ashmore, Università di Pittsburgh, PA) vengono utilizzati per esaminare rispettivamente i parametri circadiani (ad es. periodo e potenza) o sonno/riposo (ad es. percentuale di sonno, durata media del periodo di riposo).
