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Questo protocollo è un estratto da de Vries e Clandinin, Stimolazione optogenetica del comportamento di fuga in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Genera mosche Channelrhodopsin
- Cross UAS-ChR2 vola con il driver Gal4 di tua scelta, usiamo G105-Gal4, che è espresso nei neuroni Foma-1 nel lobo ottico.
- Per eliminare la possibilità di una risposta visiva alla stimolazione della luce blu, entrambe le linee di mosca sono in uno sfondo w+norpA.
- Risultato finale: w+norpA; G105-Gal4/UAS-CHR2 +
- Dopo che le mosche adulte si sono avvicinate, somministrare alle femmine selezionate cibo fresco, integrato con 10 μM di all-trans-retinale (un cofattore necessario per ChR2) e protetto dalla luce, per 3 giorni prima di eseguire il test comportamentale.
2. Prepara 10 μM di Mangime Potenziato All-trans-retinal
- Sciogliere 100 mg di all-trans-retinal in 17,6 ml di etanolo al 95% per ottenere 20 mM di retinal. Mantenere all-trans-retinal protetto dalla luce in ogni momento.
- Sciogliere il cibo standard per mosche di farina di mais nel microonde e lasciare raffreddare fino a quando non è caldo al tatto.
- Mescolare 50 μl di 20 mM all-trans-retinal in fiale da 10 ml di cibo per mosche.
- Lasciare raffreddare le fiale e conservarle al riparo dalla luce.
3. Attrezzatura
- Puntali per pipette: i puntali per pipette standard da 1.000 μl vengono tagliati vicino al puntale, creando un diametro dei pori di ~2,25 mm.
- Piattaforma (vedi Figura 1).
- Una base in Delrin, 17 cm X 25 cm, è stata costruita con fori filettati ad ogni angolo per adattarsi ai connettori del tubo del refrigerante da 1/4" NPT.
- Un supporto verticale, realizzato in Delrin, è fissato al centro della base. Le dimensioni complessive sono 25 mm X 40 mm X 65 mm (larghezza X profondità X altezza). Una scanalatura larga 10 mm corre per tutta la lunghezza del supporto, con una vite a testa zigrinata nella parte inferiore. Alla parte superiore del supporto è fissata una piattaforma, 25 mm X 40 mm X 10 mm, con un foro di 3,5 mm di diametro allineato con la scanalatura nel supporto.
- Array di LED (vedi Figura 1).
- Quattro bracci del tubo del refrigerante, lunghi ~18 cm, sono fissati alla base della piattaforma utilizzando il connettore del tubo del refrigerante. Il tubo flessibile del refrigerante viene utilizzato solo come supporto strutturale e non viene utilizzato per scopi di raffreddamento.
- Scanalature adeguatamente distanziate vengono tagliate nel pezzo finale del tubo del refrigerante di ciascun braccio per fissare un dissipatore di calore all'estremità di ciascun braccio.
- Un LED blu Rebel Tri-Stars è montato su ciascun dissipatore di calore utilizzando nastro adesivo termico pretagliato. Su ogni Tri-Star è apposta una lente Carclo 18° Tri-Lens.
- I LED Tri-Star sono collegati ai driver CC BuckPuck e a un alimentatore come specificato. Abbiamo organizzato il nostro set-up con ogni BuckPuck che alimenta due Tri-Stars in serie.
- L'illuminazione di tutti e quattro i LED Tri-Star a 700 mA ha prodotto un irraggiamento di 713 W/m2 sulla nostra piattaforma.
- Fotocamera: la fotocamera è montata su un piccolo treppiede e messa a fuoco sulla parte superiore della piattaforma.
4. Saggio comportamentale
- Anestetizzare brevemente le mosche sul ghiaccio.
- Posizionare le singole mosche nei puntali delle pipette, usando del nastro adesivo per chiudere entrambe le estremità del puntale.
- Dopo che le mosche si sono svegliate e stanno esplorando attivamente la punta della pipetta, rimuovere il nastro adesivo e posizionare una pipetta nella scanalatura del supporto verticale. La vite a testa zigrinata viene utilizzata per fissare il puntale della pipetta in posizione e per chiudere la parte inferiore del puntale.
- Mentre la mosca esplora la punta della pipetta (in genere 30 - 60 secondi), avviare la registrazione della telecamera appena prima che la mosca emerga dalla punta sulla piattaforma.
- Dopo che la mosca è emersa sulla piattaforma, attendere 1-2 secondi e accendere i LED blu. Usa un timer per misurare manualmente il tempo prima che la mosca inizi il volo.
