Questo protocollo è un estratto da Vogler e Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).
1. Prima di iniziare
- Preparare una soluzione di emolinfa artificiale (AH) appena preparata contenente 108mM Na+, 5mM K+, 2mM Ca2+, 8mM MgCl2, 1mM NaH2PO4, 4mM NaHCO3, 10mM saccarosio, 5mM trealosio, 5mM HEPES (pH 7,1, tutti i reagenti di Sigma Chemicals). Il saccarosio e il trealosio devono essere aggiunti all'AH da soluzioni madre refrigerate appena prima dell'uso per prevenire la contaminazione batterica.
- Portare l'AH a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione facendo gorgogliare all'aria per almeno 15 minuti.
- Estrarre diversi capillari sottili (ad es. capillari in vetro, 100ul, VWR) necessari per la rimozione del grasso.
2. Cuore di Drosophila semi-intatto dalla mosca adulta
- Le mosche adulte di Drosophila vengono anestetizzate con Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) per 2-5 minuti. Bisogna fare attenzione a non lasciare le mosche nel Fly Nap per esposizioni più lunghe. L'esposizione a breve termine al freddo può essere utilizzata anche per anestetizzare le mosche, ma la CO2 non è raccomandata in quanto ha effetti più duraturi sulla frequenza cardiaca e sulla ritmicità.
- Le mosche anestetizzate vengono posizionate, con la parte dorsale rivolta verso il basso, in una capsula di Petri rivestita con un sottile strato di vaselina. La cuticola idrofobica nelle ali e nel corpo si "attacca" in modo reversibile alla gelatina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Ciò diventa particolarmente importante durante le manipolazioni successive.
- Un taglio iniziale viene effettuato utilizzando un paio di forbici a molla curve (Roboz #5611). Le lame delle forbici sono posizionate sotto le gambe e inclinate verso il basso verso la superficie dorsale del torace vicino al collo. La testa, il cordone nervoso ventrale e le gambe vengono rimossi con un unico taglio. Il preparato viene quindi immerso in una soluzione di emolinfa artificiale ossigenata (AH).
- Utilizzando le forbici a molla, la punta posteriore dell'addome (composta dai segmenti addominali 7 e 8) viene rimossa con un unico taglio. Questo fornisce l'accesso per eseguire tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a recidere la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale. Il lembo liberato della cuticola addominale ventrale viene quindi rimosso.
- Nelle fasi 3 e 4 le connessioni anteriore e posteriore dell'intestino vengono recise in modo che gli organi addominali siano ora tenuti in posizione solo da tracheoli. L'intestino e altri organi addominali di solito possono essere rimossi come un'unica massa usando una pinza da gioielliere (Roboz, #55) e uno strattone delicato. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco pulsante ancora attaccato alla cuticola dorsale circondato da corpi adiposi.
- I corpi adiposi sono abbastanza opachi al microscopio ottico, di conseguenza è spesso necessario rimuovere parte di questo grasso per vedere chiaramente il tubo cardiaco. Ciò si ottiene con una tecnica di liposuzione che utilizza capillari di vetro finemente disegnati. I capillari vengono realizzati utilizzando un estrattore per pipette standard (ad es. estrattore per pipette Sutter P-97) e vengono quindi inseriti in un tubo di plastica (Tygon, 1/16") collegato a una fonte di vuoto. Questo sistema viene utilizzato per aspirare il grasso in eccesso intorno al tubo cardiaco. La forza di aspirazione è proporzionale al diametro del puntale, pertanto non è necessario utilizzare pipette con puntali di diametro superiore a 40 micron. Bisogna prestare la massima attenzione per evitare di toccare il cuore stesso e poiché la parte posteriore del cuore è molto fragile, quella regione dovrebbe essere evitata del tutto.
- Il tubo cardiaco adulto di Drosophila è ora esposto e dovrebbe battere. Se necessario, la cuticola e il cuore attaccato possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla vaselina e pressandola con cura, evitando nuovamente qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto la soluzione che bagna il preparato deve essere sostituita con AHL fresco. Questo preparato deve essere lasciato equilibrare per 20-30 minuti con ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione. Se il preparato deve essere mantenuto per più di 60 minuti, deve essere perfuso con AHL fresco.
