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Questo protocollo è un estratto da Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Posing Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).
1. Costruzione della camera, assemblaggio, configurazione del saggio
- Chiedi a un'officina meccanica di costruire camere di deposizione delle uova in acrilico (Figura 1A-D). I disegni tecnici dei diversi pezzi sono stati mostrati nella Figura supplementare 1-3. Qui si possono trovare anche immagini ad alta risoluzione (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserire fogli di plastica nel pezzo di caricamento (superiore) della camera come mostrato in Figura 1C. Questo funge da superficie inferiore durante il caricamento delle mosche nelle singole arene per la deposizione delle uova.
- Anestetizzare le femmine su un tampone di CO2 e caricarle singolarmente in ogni arena di deposizione delle uova. Attendere ~30 minuti affinché le mosche si riprendano dalla CO2 e si acclimatino al nuovo ambiente.
- Preparare i substrati di agarosio.
- Per comodità, conservare un flacone preconfezionato di agarosio fuso all'1% a bagnomaria a 55 °C.
- Aggiungere la quantità desiderata di soluzione madre di saccarosio (2 M) in un tubo conico da 50 ml e mescolarla con una quantità appropriata di agarosio. Ad esempio, per preparare il substrato di saccarosio da 150 mM, inserire 750 μl di soluzione di saccarosio 2 M nella provetta e quindi riempire la provetta con agarosio fino al segno di 10 ml.
- Preparare il substrato semplice allo stesso modo, ma aggiungere acqua distillata invece della soluzione di saccarosio.
NOTA: La concentrazione finale di agarosio in questo protocollo è leggermente inferiore all'1%. Nella nostra esperienza, l'esatta concentrazione di agarosio non ha importanza fintanto che è controllata entro ~0,9 - 1,1% e che i due substrati abbiano la stessa concentrazione di agarosio.
- Prendere il pezzo di substrato (inferiore) della camera e pipettare 1.000 μl di substrato di agarosio in ogni trogolo come mostrato in Figura 1D.
- Lasciare solidificare l'agarosio per ~30 minuti.
- Una volta che i substrati di agarosio e le mosche sono pronti, assemblare tutti e tre i pezzi della camera di deposizione delle uova e poi estrarre i fogli di plastica.
- Posizionare le camere nelle incubatrici a mosca.
NOTA: La durata degli esperimenti di deposizione delle uova può variare a seconda delle esigenze sperimentali. In genere eseguiamo l'esperimento O/N (14 - 16 ore). Inoltre, non è stato osservato alcun impatto significativo della tempistica circadiana sulle preferenze di deposizione delle uova.
- Anestetizzare le femmine iniettando CO2 nella camera. Smontare la camera, gettare le mosche anestetizzate nell'obitorio delle mosche (cioè una lattina di caffè vuota riempita con un po' di olio di mais). Scattare foto dei risultati per la registrazione (vedere Figura 2).
- Conta manualmente il numero di uova e calcola gli indici di preferenza per l'analisi. Calcola l'indice di preferenza come (Na - Nb)/(Na + Nb) dove Na e Nb rappresentano rispettivamente il numero di uova nel sito a rispetto al sito b.
