C. elegans Dissezione del blastomero: un metodo per rimuovere il guscio dell'uovo e dissociare le cellule embrionali

Abstract

Fonte: Hsu, C. R., et al. Ricostituzione in vitro di modelli di contatto cellulare spaziale con blastomeri embrionali isolati di Caenorhabditis elegans e perline di polistirene adesive.J. Vis. Exp.(2019).

Questo video presenta un metodo per isolare i blastomeri di C. elegans dai primi embrioni. Le cellule risultanti sono adatte per colture cellulari o esperimenti ex vivo.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Hsu et al, Ricostituzione in vitro di modelli di contatto cellulare spaziale con blastomeri embrionali isolati di Caenorhabditis elegans e perle di polistirene adesivo, J. Vis.(2019).

1. Isolamento del blastomero embrionale
2. Indossare guanti e camice da laboratorio per evitare tagli e contatto con la soluzione sbiancante.
   1. Tenere ciascuna estremità di un microcapillare (capacità; 10 μL) con la mano destra e sinistra.
   2. Tirare il microcapillare verso entrambe le estremità per applicare tensione e portare il centro del capillare su un bruciatore per creare due capillari tirati a mano (Figura 1A).
   3. Tagliare le punte dei capillari tirati a mano con una pinza al microscopio da dissezione e collegare il capillare estratto in un apparecchio di pipettaggio orale. Preparare due tipi di pipette. Le dimensioni dell'apertura del puntale per le pipette devono essere circa 2x e 1x la lunghezza dell'asse corto degli embrioni di C. elegans (30 μm) rispettivamente per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo, Figura 1B-D).
   4. Pipettare 45 μl di soluzione di sale d'uovo su un pozzetto di un vetrino multipozzetto (Figura 2A; in basso).
   5. Metti 5-10 esemplari adulti di C. elegans su un pozzetto contenente una soluzione di sale d'uovo.
   6. Per ottenere embrioni precoci di C. elegans, tagliare gli adulti in pezzi posizionando due aghi a destra e a sinistra del corpo di C. elegans e facendo scorrere gli aghi l'uno accanto all'altro (Figura 2A; schemi superiori).
   7. Pipettare 45 μl di soluzione di ipoclorito in un pozzetto accanto al pozzetto contenente la soluzione di sale d'uovo (Figura 2B).
   8. Pipettare 45 μl di terreno di crescita di Shelton nei tre pozzetti successivi accanto al pozzetto contenente la soluzione di ipoclorito (Figura 2B).
   9. Trasferire gli embrioni allo stadio di 1 cellula e allo stadio iniziale di 2 cellule nella soluzione di ipoclorito mediante pipettaggio per bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione (Figura 2B).
   10. Attendere 40-55 secondi.
   11. Lavare gli embrioni trasferendoli dalla soluzione di ipoclorito nel terreno di crescita di Shelton mediante pipettaggio orale con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 2B).
   12. Lavare nuovamente gli embrioni trasferendoli in un nuovo pozzetto del terreno di crescita di Shelton mediante pipettaggio orale con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 2B).
   13. Trasferire gli embrioni lavati in un nuovo pozzetto del terreno di coltura di Shelton mediante pipettaggio orale con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni. Utilizzando il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo, ripetere attentamente il pipettaggio (Figura 2C; schemi centrali). Se il guscio d'uovo viene rimosso con successo, le cellule embrionali diventeranno più sferiche (Figura 2C; a destra).
   14. Separare i blastomeri embrionali allo stadio a 2 cellule mediante pipettaggio delicato e continuo con il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo (Figura 2D).

Figura 1: Isolamento dei blastomeri.(A) Estrazione manuale del capillare di vetro. (B) Capillare in vetro trafilato a mano per il trasferimento di embrioni. (C) Capillare in vetro disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo. (D) Schemi che mostrino la dimensione appropriata dell'apertura capillare per la rimozione del guscio d'uovo. Le frecce indicano gli embrioni. Le barre della scala mostrano 100 μm.

Figura 2: Flusso di lavoro per l'isolamento dei blastomeri.(A) Dissezione di C. elegans adulto in tampone di sale d'uovo per ottenere embrioni. Le fotografie mostrano embrioni a 2 e 4 cellule prima della rimozione del guscio d'uovo. (B) Trattamento e lavaggio con ipoclorito. (C) Gli schemi illustrano il momento appropriato per la rimozione del guscio d'uovo. La fotografia mostra un embrione in stadio di 4 cellule dopo la rimozione del guscio d'uovo. (D) Separazione dei blastomeri. La fotografia mostra un embrione separato in fase di 2 cellule. Le dimensioni delle frecce in C e D indicano le forze relative richieste durante il pipettaggio. Le barre della scala mostrano 50 μm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Assemblaggio tubo aspiratore	Drummond	21-180-13	Per l'isolamento del blastomero.
Caenorhabditis elegans ceppo: N2, wild-type	Centro di Genetica Caenorhabditis	N2	Ceppo utilizzato in questo studio
Caenorhabditis elegans ceppo: KSG5, genotipo: zuIs45; itIs37	in casa	KSG5	Ceppo utilizzato in questo studio
Mircopipette calibrate, 10 μl	Drummond	21-180-13	Per l'isolamento dei blastomeri
CD Concentrato lipidico	Tecnologie per la vita	11905031	Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Clorox	Clorox	N. A.	Per l'isolamento dei blastomeri. Aprire un nuovo flacone quando il trattamento con ipoclorito non funziona bene.
Porta vetrino coprioggetti	In casa	N.A.	Per l'isolamento dei blastomeri.
Microscopio da dissezione: Zeiss Stemi 508 con supporto M. La fonte di luce è il LED incorporato. L'ingrandimento dell'oculare è 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	Per l'isolamento dei blastomeri.
Siero fetale bovino, One Shot qualificato, origine Canada	Gibco	A3160701	Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Aghi ipodermici per uso generale e scorrimento di precisione, calibro 25	Bd	14-826AA	Per l'isolamento dei blastomeri
Inulina	Alfa Aesar	AAA1842509	Per l'isolamento dei blastomeri
MEM Soluzione vitaminica (100x)	Gibco	11120052	Per l'isolamento dei blastomeri.
Multitest Vetrino 10 Pozzetti	MP Biomedicali	ICN6041805	Per l'isolamento dei blastomeri
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140148	Per l'isolamento dei blastomeri.
Polivinilpirrolidone	Fisher BioReagenti	BP431-100	Per l'isolamento dei blastomeri
Cloruro di potassio	Bioshop	POC888	Per l'isolamento dei blastomeri
Terreno sterile per Drosophila	Gibco	21720024	Per l'isolamento dei blastomeri. Lavorare nella cappa di coltura tissutale.
Cloruro di sodio	Bioshop	SOD001	Per l'isolamento dei blastomeri
Soluzione di idrossido di sodio, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	Per l'isolamento dei blastomeri
Filtri per siringhe, PTFE, non sterili	Basix	13100115	Per l'isolamento dei blastomeri.
Tygon S3 Tubi da Laboratorio,, Formulazione E-3603, Diametro interno 3.175 mm	Plastiche ad alte prestazioni Saint Gobain	89403-862	Per l'isolamento dei blastomeri.
Tygon S3 Tubi da Laboratorio,, Formulazione E-3603, Diametro interno 6.35 mm	Plastiche ad alte prestazioni Saint Gobain	89403-854	Per l'isolamento dei blastomeri.