Il seguente protocollo è un estratto da Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).
- Preparazione di organismi sperimentali
- Prelevare 10 nematodi stadi L4 per ceppo 24 ore prima di iniziare il test per assicurarsi che gli organismi siano giovani adulti quando vengono testati. Per ogni nematode mutante o di controllo testato, scegliere 10 L4 (10 per il controllo e 10 per il test).
- Mantenere gli organismi L4 utilizzando metodi standard per 24 ore su piastre di agar standard seminate con OP50 Escherichia coli. Se gli organismi vengono persi durante le successive fasi di lavaggio, compensare aumentando la dimensione del campione iniziale (ad esempio, prelevare 20 vermi anziché 10).
NOTA: Il comportamento è un fenotipo innatamente variabile. Esegui il metodo in triplice copia per ogni ceppo in tre giorni separati. Includere ulteriori ceppi di controllo e condizioni per nuovi ceppi, come evidenziato nella sezione di discussione.
- Immediatamente prima del saggio, trasferire gli organismi sperimentali su una piastra di agar priva di batteri e lasciare che i nematodi si muovano liberamente per 1 minuto per rimuovere i batteri in eccesso.
- Se gli organismi sperimentali hanno sperimentato condizioni di contaminazione durante le 24 ore precedenti il test, scartarli.
- Pipettare 1 mL di M9 sulla piastra priva di batteri per lavare i vermi in una provetta per microcentrifuga.
- Centrifugare a 3.000 x g per 1 minuto. I vermi dovrebbero formare un pellet sul fondo della provetta. Aspirare la soluzione M9 senza interrompere il pellet della vite senza fine. Aggiungere 1 mL di M9 al pellet di vermi, capovolgere la provetta per mescolare i vermi con la soluzione.
- Ripetere i passaggi 1.4 altre tre volte.
- Se i batteri in eccesso sono stati inizialmente trasferiti con i vermi, ripetere l'operazione per un totale di 5 volte. Nessun batterio deve essere trasferito sui piatti da gara in rame. Se il cibo viene trasferito nella piastra di analisi, interferisce con la raccolta accurata dei dati.
- Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a 100 μL di M9 e il pellet di verme rimane.
Attenzione: i comportamenti legati alla fame diventano evidenti dopo 30 minuti. Di conseguenza, i vermi devono essere trasferiti immediatamente dalla soluzione una volta completate le fasi di lavaggio.
- Preparazione delle piastre di analisi
- Preparare le piastre standard per agar NGM due giorni prima del saggio.
- Se le piastre vengono conservate in un ambiente umido, preparare le piastre di agar 3 giorni prima del saggio. In alternativa, rimuovere il coperchio della piastra per 3 - 6 ore per garantire una corretta asciugatura (se in un ambiente sterile).
- Con un pennarello indelebile spesso, tracciare una linea sul lato inferiore della piastra lungo il bordo esterno e un'altra per formare una barriera della linea mediana (Figura 1). La barriera della linea mediana deve essere equidistante da ciascun bordo della piastra. Usa un righello per garantire misurazioni precise. Queste linee serviranno come guida durante il trasferimento dei batteri e della soluzione di rame. A condizione che E. coli venga trasferito prima della soluzione di rame, queste linee serviranno da indicatori.
- Piastra di semina con 50 μl di OP50 E. coli su un solo lato della barriera di rame per creare un prato uniforme (Figura 2). La concentrazione batterica deve rimanere costante tra i saggi; Tuttavia, è stata osservata una scarsa variabilità in risposta a lievi differenze di concentrazione.
- Utilizzare le linee contrassegnate sul lato inferiore della piastra per assicurarsi che i batteri non entrino in contatto con la soluzione di rame. A condizione che la soluzione di rame rivesta il bordo della piastra e formi una barriera mediana, trasferire i batteri in modo che la soluzione di rame non entri in contatto con la fonte di cibo.
- Contrassegnare una seconda serie di piastre e non trasferire su di esse alcun OP50 E. coli (Figura 2). Queste piastre serviranno a valutare il controllo negativo. Queste piastre dovrebbero anche avere una marcatura su una metà della piastra per indicare l'origine del trasferimento iniziale.
- Lasciare asciugare i batteri, quindi incubare le piastre a 37 °C per una notte. Assicurarsi che le macchie batteriche non vengano disturbate durante il trasferimento in un'incubatrice o in una stanza a 37 °C. Un disturbo eccessivo potrebbe alterare la posizione o la forma dell'area di cibo.
- Dosaggio della chemiotassi
- Preparare una soluzione di solfato di rame (II) 0,5 M prima dell'inizio del saggio. A condizione che vengano utilizzati 125 μl di soluzione per piastra, aumentare questo volume in base al numero di piastre di saggio utilizzate (ad es. 5 piastre di analisi, 625 μl).
- Pipettare 100 μl della soluzione di solfato di rame (II) sul bordo dell'agar per creare una barriera esterna di rame. La parte inferiore contrassegnata della piastra dovrebbe fungere da guida.
- Pipettare 25 μl della soluzione di solfato di rame (II) per creare una barriera mediana.
- Assicurarsi che la soluzione di solfato di rame (II) non entri in contatto con il cerotto batterico. Utilizzare una tecnica maculata poiché le striature possono influire sulla locomozione a causa di rientranze/graffi sull'agar.
- Lasciare asciugare la soluzione di rame sulla piastra. Il periodo di tempo può variare a seconda delle condizioni della piastra e del laboratorio. Controllare visivamente la secchezza ogni 5 minuti dopo il trasferimento.
NOTA: La soluzione di rame mostra una tinta bluastra ed è facilmente identificabile. Utilizzare un fazzoletto di carta da laboratorio per tamponare leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per discernere la secchezza.
- Pipettare 20 μl di pellet di verme dal fondo della provetta sulla metà priva di batteri della piastra del saggio.
- Assicurarsi che 10 vermi vengano trasferiti sulla piastra di analisi. Se sono stati accidentalmente inclusi vermi extra, rimuoverli raccogliendoli con olio di alocarburi per assicurarsi che non vengano aggiunti batteri alla piastra. Ogni test dovrebbe avere un numero costante di nematodi durante il test.
NOTA: Se durante i saggi vengono trasferiti troppo pochi vermi, l'aumento della dimensione iniziale del campione ridurrà le potenziali perdite durante i lavaggi e i trasferimenti.
- Rimuovere l'eccesso di M9 dalla piastra con un fazzoletto di laboratorio. M9 non deve entrare in contatto con la soluzione di solfato di rame (II).
Attenzione: Assicurarsi che i vermi e la superficie dell'agar rimangano inalterati durante l'esecuzione di questo passaggio. Se usato troppo duramente, il tessuto di laboratorio può creare rientranze sulla superficie dell'agar della piastra e può rimuovere i vermi. I worm rimossi accidentalmente tramite KimWipe devono essere eliminati.
- Una volta che la soluzione M9 è stata rimossa e tutti i vermi hanno iniziato i modelli locomotori non liquidi, avviare il cronometro del saggio.
- In modo ottimale, rimuovere la soluzione M9 entro un minuto. Il parametro essenziale è l'identificazione della locomozione sinusoidale. I vermi si muovono in modo diverso, ad esempio dimenandosi piuttosto che sinusoidalmente, quando sono in liquido. Avviare il cronometro del test non appena ciascuno degli organismi sperimentali smette di dimenarsi.
- Controllare le piastre di analisi ogni 30 minuti.
- Per le piastre di analisi con patch batteriche, assegnare un punteggio positivo agli organismi che raggiungono il patch alimentare nell'arco di un periodo di 4 ore. Per le piastre di controllo negative, valutare positivamente gli organismi che hanno attraversato la barriera.
