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Questo protocollo è un estratto da Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Imaging del calcio
- Utilizzare ceppi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati come HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Utilizzare un microscopio composto attrezzato per l'epifluorescenza ad ampio campo. Collegare l'uscita TTL della telecamera EMCCD all'ingresso TTL del LED, in modo che ogni volta che la telecamera registra un fotogramma il campione si illumini. Utilizzare un tempo di esposizione di circa 5 msec. Usa il guadagno EM nell'intervallo 50 - 300.
- Specificare un filmato burst in esecuzione per 24 ore con ogni verme che viene ripreso ogni 15-30 minuti prima per 20 secondi con DIC, quindi per 20 secondi con una fluorescenza GFP per registrare GCaMP, quindi scattare un'immagine finale del segnale mKate2 per controllare i livelli di espressione. Utilizzare una frequenza fotogrammi di 2/sec durante ogni sequenza.
- Per l'ispezione visiva dei dati, utilizzare una mappa a falsi colori per migliorare la visibilità di piccole variazioni dell'intensità della fluorescenza. Tracciare i dati fluorescenti come ΔF/F, dove F è il valore medio di base della fluorescenza. Una descrizione dettagliata dell'analisi dei dati sul calcio è disponibile in letteratura.