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Questo protocollo è estratto da Teoh et al, Approcci quantitativi per lo studio delle strutture cellulari e della morfologia degli organelli in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Quantificare la struttura muscolare della parete corporea
- Imaging a fluorescenza della struttura muscolare della parete corporea
- Ottenere un ceppo (ad esempio, RW1596) che trasporta il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), che marcare le fibre di miosina con GFP.
NOTA: L'introduzione del transgene negli animali può essere ottenuta incrociando un ceppo di interesse con animali che già esprimono il transgene, o microiniettando DNA nel braccio distale della gonade. Il fenotipo "rotante" indotto dalla mutazione rol-6 in questo transgene facilita la visualizzazione dei muscoli. I muscoli della parete corporea corrono lungo i lati dorsale e ventrale che normalmente sono preclusi alla vista negli animali selvatici perché in genere giacciono su uno dei loro lati laterali. L'allele rol-6 (su1006) induce la torsione degli animali, esponendo così alcune cellule muscolari per l'imaging.
- Imaging degli animali utilizzando un microscopio a fluorescenza accoppiato con una fotocamera ad accoppiamento caricato (CCD) ad alta risoluzione, obiettivo 40X o superiore, filtro GFP e software di acquisizione.
- Regolare il tempo di esposizione e l'intensità dell'illuminazione per evitare immagini sovrasature.
- Cattura e salva immagini dei muscoli (ingrandimento 400X) da una sezione dell'animale contenente almeno una cellula muscolare obliqua visibile completa. Evita le regioni con una singola cellula muscolare incompleta o sezioni sfocate. Escludere anche le immagini provenienti dalle regioni anteriori e posteriori estreme e dalle regioni adiacenti alla vulva.
NOTA: Se l'animale non ha una singola cellula muscolare completa visibile, far scorrere delicatamente il vetrino coprioggetti per girare l'animale in modo da esporre una cellula completa.
- Misurazione dell'area delle cellule muscolari
- Apri l'immagine nel software Fiji (in questo studio è stata utilizzata la versione 2.0.0).
- Usa la selezione del poligono per tracciare attentamente attorno a una singola cellula muscolare obliqua. Regola la linea del poligono alla fine trascinando il punto di ancoraggio per migliorare il tracciamento.
- Vai alla scheda Analizza nella parte superiore del software e fai clic su Misura per calcolare l'area della selezione. Verrà mostrata una tabella dei risultati separata contenente l'area e altre misurazioni. Se la misurazione dell'area non è presente nella tabella dei risultati, andare su Imposta misure nella scheda Analizza e verificare che la casella dell'area sia selezionata. Allo stesso modo, deseleziona le altre misurazioni che non sono necessarie.
- Per le cellule muscolari con una regione degenerata/mancante, tracciare la regione mancante con lo strumento di selezione del poligono e fare nuovamente clic su Misura. Se ci sono più spazi vuoti all'interno della cella, tracciare ogni spazio separatamente.
- Calcola il rapporto tra l'area del gap e l'intera singola cellula muscolare. Un rapporto elevato indica una maggiore estensione della degenerazione muscolare a causa di grandi spazi vuoti all'interno della cellula. Se non ci sono regioni mancanti, come si vede comunemente negli animali selvatici, il rapporto sarebbe calcolato come zero.
NOTA: Come controllo, valutare visivamente anche i difetti della struttura muscolare e confrontare i risultati con la misurazione quantitativa. Ciò è particolarmente utile se il ceppo viene studiato per la prima volta in laboratorio. Per il punteggio fenotipico, valutare gli animali come difettosi o non difettosi in base all'integrità dei filamenti. Ad esempio, gli animali con perdita di striature filamentose distinte, aggregazione di GFP o lacune all'interno delle cellule muscolari a causa di una rottura strutturale, verrebbero classificati come difettosi.