Questo protocollo è un estratto da Xu e Chisholm, <a href="https://www.jove.com/video/51959/methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans">Metodi per ferire la pelle e saggi per le risposte alle ferite in C. elegans</a>, J. Vis. Exp. (2014).
1. Avvolgimento laser
NOTA: Usa l'irradiazione laser a femtosecondi (800 nm) per eseguire una ferita più precisa.
<ol>
	<li>Preparare i tamponi di agar su un vetrino di vetro con agar sciolto al 2%. Assicurarsi che i cuscinetti siano simili ai cuscinetti di agar utilizzati per l'imaging dal vivo di C. elegans.</li>
	<li>Trasferire 10 giovani vermi adulti sul tampone di agarosio con il vermicompost e aggiungere una goccia da 2 μl di soluzione di Levamisolo da 12 mM. Copri gli animali e il liquido con un vetrino coprioggetto. Attendi 1-2 minuti che i vermi si paralizzino.</li>
	<li>Posizionare il vetrino su un microscopio confocale a disco rotante. Muovi il palco per trovare i vermi e concentrati sull'epidermide sinciziale laterale, anteriore o posteriore con un obiettivo 100X (NA 1,4-1,46).</li>
	<li>Impostare la potenza del laser a femtosecondi su 140 mW (misurata prima dell'obiettivo). Utilizzare il laser a femtosecondi a una frequenza di ripetizione di 80 MHz. 
	NOTA: Due impulsi di 200 msec ciascuno (separati da 20 msec) sono sufficienti per ferire le nostre mani.</li>
	<li>Concentrati sulla superficie apicale della cellula epidermica e avvolgi l'epidermide. Osservare l'interruzione locale del citoplasma (gorgogliamento) o lo sbiancamento locale di qualsiasi marcatore fluorescente utilizzato. 
	NOTA: Seguire le procedure di sicurezza laser appropriate quando si utilizza il laser a femtosecondi. Le scansioni lineari o a punti che utilizzano laser a femtosecondi, come quelli dei microscopi a due fotoni, dovrebbero fornire una potenza sufficiente per l'avvolgimento laser. 
	NOTA: Anche se non abbiamo esperienza diretta nell'uso di altri laser, in linea di principio la ferita dovrebbe essere possibile utilizzando i laser UV convenzionali (come quelli utilizzati nelle ablazioni cellulari di C. elegans). Opzionalmente, utilizzare un modulo FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) su disco rotante confocale per avvolgere l'epidermide (N. Pujol, comunicazione personale).</li>
</ol>

ferita laser epidermica: induzione di danni localizzati per esaminare i processi di riparazione in c. elegans

Epidermal Laser Wounding: Inducing Localized Damage to Examine Repair Processes in C. elegans

Fonte: Xu, S. e Chisholm, A. D. <a href="https://www.jove.com/video/51959/methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans">Metodi per le ferite cutanee e saggi per le risposte alle ferite in C. elegans.</a>J. Vis. Exp.(2014).
Questo video introduce un metodo di ferita laser, che viene utilizzato per causare lesioni molto precise nell'epidermide del verme. Il protocollo di esempio proviene da uno studio sulla risposta e la riparazione delle ferite.

Ferita laser epidermica: induzione di danni localizzati per esaminare i processi di riparazione in C. elegans

Fonte: Xu, S. e Chisholm, A. D. Metodi per le ferite cutanee e saggi per le risposte alle ferite in C. elegans. J. Vis. Exp. (2014).
Questo video ...

- Per iniziare, trasferisci i giovani vermi adulti su un tampone di agarosio fresco su un vetrino. Quindi aggiungere alcune gocce di soluzione di levamisolo da 12 millimolari per paralizzare i vermi. Coprite i vermi con un vetrino coprioggetti e aspettate qualche minuto. Posizionare il vetrino sotto un microscopio confocale a disco rotante e mettere a fuoco la superficie laterale più esterna del verme. L'epidermide di un verme adulto è una sottile struttura a strato singolo costituita da sincizi multinucleati che derivano da eventi di fusione cellulare. La superficie apicale dell'epidermide secerne una cuticola collagenica flessibile, mentre la superficie basale è ricoperta da un sottile strato di matrice extracellulare chiamato lamina basale. Successivamente, avvolgere la superficie apicale dell'epidermide con un laser. Il citoplasma dalle cellule danneggiate può fuoriuscire, apparendo come una bolla nel sito della ferita. L'irradiazione laser ha un vantaggio rispetto ad altre tecniche, come l'avvolgimento dell'ago, in quanto provoca una rottura localizzata della cuticola e delle cellule epidermiche, senza danneggiare i tessuti interni. Nel protocollo di esempio, vedremo il processo di ferimento laser in C. elegans. - Per ferire con precisione i nematodi, questo protocollo utilizza un laser a femtosecondi collegato al microscopio confocale a disco rotante. Anche le scansioni lineari o a punti con laser a femtosecondi, come quelle dei microscopi a due fotoni, dovrebbero essere sufficienti. - Inizia raccogliendo 10 giovani adulti su un pad agar. Paralizzarli in una goccia da due microlitri di soluzione di levamisolo da 12 millimolari. Quindi coprili con un vetrino coprioggetti e attendi qualche minuto mentre si paralizzano. - È essenziale che un animale sia completamente paralizzato. 12 millimolari di levamisolo non influenzeranno la risposta della ferita. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri metodi di immobilizzazione. - Assicurarsi che la potenza del laser a femtosecondi sia impostata su 140 milliwatt, misurata prima dell'obiettivo, e che la frequenza di ripetizione del laser sia di 80 megahertz. Ora, localizza i vermi sotto un microscopio confocale a disco rotante. Utilizzando un obiettivo 100x con un'elevata apertura numerica, mettere a fuoco l'epidermide sinciziale laterale anteriore o posteriore del verme bersaglio. Concentrandosi sulla superficie apicale della cellula epidermica, far brillare il laser per due impulsi di 200 millisecondi separati da 20 millisecondi. Questo dovrebbe essere sufficiente per ferire l'epidermide. Aspetta un momento e osserva l'interruzione locale del citoplasma, che apparirà come gorgogliamento. Se è presente un marcatore fluorescente, si può osservare uno sbiancamento localizzato.

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Ferita laser epidermica: induzione di danni localizzati per esaminare i processi di riparazione in C. elegans

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