Alimentazione FITC-destrano: un metodo per quantificare la permeabilità intestinale in C. elegans

Abstract

Fonte: Le, T. A. N., et al. Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

Questo video introduce un metodo per visualizzare e misurare l'integrità del lume intestinale di C. elegans alimentando vermi con destrano marcato FITC. Il protocollo di esempio mostra il test eseguito con vermi trattati con 3,3'-diindolilmetano (DIM) e alimentati con agenti patogeni.

Protocollo

Questo protocollo è un estratto da Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparazione di piastre NGM per testare gli effetti di una sostanza chimica (DIM) sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentata con P. aeruginosa
   1. Aggiungere 0,5 g di peptone, 0,6 g di NaCl, 195 ml di acqua distillata, un agitatore magnetico e 6,8 g di agar in una bottiglia di vetro da 500 ml (agar NGM).
   2. Aggiungere 0,5 g di peptone, 0,6 g di NaCl, 195 ml di acqua distillata e un agitatore magnetico senza agar a un'altra bottiglia di vetro da 500 ml (brodo NGM).
   3. Autoclavare in autoclave i due flaconi (dai passaggi 1.1 a 1.2), un flacone di vetro vuoto da 100 ml e un flacone di vetro vuoto da 500 ml per 15 minuti a 121 °C. Lasciare quindi raffreddare il terreno contenente le bottiglie a 55 °C a bagnomaria per 30 minuti. Conservare il terreno di agar a bagnomaria e rimuovere il flacone contenente il brodo (dal passaggio 1.2) per il passaggio successivo.
   4. Aggiungere gli additivi chimici al brodo NGM: 0,4 mL di 1 M CaCl₂, 0,4 mL di colesterolo in etanolo (mL), 0,4 mL di 1 M MgSO₄ e 10 mL di 1 M KPO₄ (tutti questi componenti devono essere sterilizzati a parte il colesterolo nell'etanolo). Quindi, mescolare accuratamente il composto con un agitatore magnetico a 55 °C.
   5. Etichettare il flacone di vetro vuoto da 500 ml autoclavato con dimetilsolfossido (DMSO) e il flacone di vetro vuoto da 100 ml autoclavato con DIM.
   6. Trasferire 50 ml di brodo NGM nel flacone da 100 ml etichettato DIM. Aggiungere 500 μl di 20 mM DIM di brodo nel flacone e mescolare bene.
      NOTA: DIM è disciolto in DMSO (20 mM di stock DIM).
   7. Rimuovere rapidamente il terreno di coltura NGM agar dal bagnomaria, aggiungere 50 ml di terreno di coltura NGM agar nel flacone etichettato DIM e mescolare accuratamente.
   8. Introdurre un'aliquota di 20 ml di terreno NGM contenente DIM in ciascuna piastra di Petri da 90 mm x 15 mm. Da questo passaggio è possibile realizzare circa cinque lastre NGM contenenti DIM.
      NOTA: La concentrazione finale di DIM in ogni piastra NGM sarà di 100 μM.
   9. Per preparare la piastra NGM contenente DMSO, trasferire 150 ml di brodo NGM nella bottiglia da 500 ml etichettata con DMSO. Aggiungere 1,5 mL di DMSO al flacone e mescolare bene.
   10. Aggiungere 150 ml di terreno di coltura agar NGM al flacone etichettato con DMSO e mescolare accuratamente.
   11. Introdurre un'aliquota di 20 mL di terreno NGM contenente DMSO in ciascuna piastra di Petri da 90 mm x 15 mm. Da questo passaggio è possibile realizzare circa quindici lastre NGM contenenti DMSO.
       NOTA: La concentrazione finale di DMSO in ogni piastra NGM sarà dello 0,5%.
   12. Solidificare le piastre a temperatura ambiente per almeno 3 ore e conservarle a 4 °C fino al momento dell'uso.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   13. Rimuovere la coltura di E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 dal frigorifero a 4 °C e agitare correttamente la coltura prima di distribuirla sulle piastre NGM.
   14. Mettere 800 μl di coltura batterica PAO1 di E. coli OP50 o P. aeruginosa su ciascuna piastra di agar NGM fresca e lasciare asciugare le piastre in un incubatore a 20 °C per una notte.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Per il terzo esperimento (Figura 1), sono state preparate due piastre NGM contenenti DMSO rivestite con E. coli OP50 vivo, una piastra NGM contenente DMSO rivestita con P. aeruginosa PAO1 vivo e una piastra NGM contenente DIM rivestita con P. aeruginosa PAO1 vivo.
2. Trattamento di batteri o DIM e FITC-destrano Alimentazione
   1. Incubare le uova sincronizzate per l'età a 20 °C per 64 ore su piastre NGM integrate con E. coli OP50 vivo come cibo.
   2. Lavare la larva L4 sincronizzata con l'età con S-buffer e trasferirla (più di circa 500 vermi) nelle piastre NGM di trattamento contenenti diversi batteri e sostanze chimiche. Incubarli a 20 °C per 48 h.
      NOTA: Il tempo di trattamento può variare da 24 a 72 ore, a seconda dei batteri e delle sostanze chimiche utilizzate. L'effetto terapeutico o preventivo del DIM può anche essere valutato pretrattando i vermi con agenti patogeni e poi trattando i vermi con DIM (l'effetto terapeutico) o pretrattando i vermi con DIM e poi trattandoli con agenti patogeni (l'effetto preventivo).
   3. Per preparare le piastre integrate con FITC-destrano, mescolare 2 ml di E. coli OP50 inattivato termicamente con 4 mg di FITC-destrano. Quindi, dividere 100 μl della miscela FITC-destrano ed E. coli OP50 in venti piastre di agar NGM fresche (60 mm x 15 mm) e lasciare asciugare le piastre per 1 ora su un banco pulito.
      NOTA: La concentrazione finale di FITC-destrano in ogni piastra NGM sarà di 20 μg/mL.
   4. Preparare cinque piastre NGM contenenti E. coli OP50 senza FITC-destrano per il trattamento di controllo del veicolo. A tale scopo, dividere 100 μL di E. coli OP50 inattivato termicamente in ciascuna piastra di agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) e lasciare asciugare le piastre per 1 ora su un banco pulito.
      NOTA: Per ogni esperimento indipendente, sono necessarie quindici piastre NGM integrate con FITC destrano e cinque piastre NGM senza FITC-destrano.
   5. Dopo 48 ore di trattamento (dal punto 2.2), lavare i vermi con S-tampone, trasferire i vermi nelle piastre integrate con FITC-destrano e nelle piastre NGM senza FITC-destrano e incubare le piastre durante la notte (14-15 ore).
      NOTA: Per ogni gruppo di trattamento, sono necessarie 5 repliche della colorazione FITC-destrano (o alimentazione di controllo del veicolo).
   6. Lavare i vermi con S-buffer e lasciarli strisciare nella piastra di agar NGM fresca per 1 h.
      NOTA: Per ogni esperimento indipendente, sono necessarie un totale di 20 piastre NGM fresche. In questa fase, è possibile utilizzare la piastra NGM integrata senza o con E. coli OP50.
   7. Aggiungere 50 μl di soluzione di formaldeide al 4% a ciascun pozzetto di una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti. Trasferire circa 50 vermi da ciascuna piastra NGM in ciascun pozzetto per le misure di fluorescenza. Dopo 1 o 2 minuti, rimuovere accuratamente tutta la formaldeide da ciascun pozzetto e aggiungere 100 μL di terreno di montaggio per rivestire i pozzetti.
      NOTA: La soluzione di formaldeide (4%) viene utilizzata per immobilizzare e riparare i vermi. Per ogni gruppo di trattamento, vengono utilizzati 5 pozzetti (5 repliche) per l'analisi delle immagini.
3. Imaging di C. elegans con il sistema di imaging Operetta e determinazione della permeabilità intestinale misurando l'assorbimento di fluorescenza FITC-destrano
   NOTA:La stereomicroscopia fluorescente può essere utilizzata per l'analisi delle immagini al posto del sistema Operetta.
   1. Acquisisci immagini a fluorescenza e misura l'intensità della fluorescenza utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto Operetta e analizza le immagini con il software Harmony.
   2. Nel software Harmony, premere l'icona Apri coperchio per aprire il coperchio e inserire la piastra nella macchina.
   3. Impostare i parametri.
   4. Fare clic su Configurazione, selezionare il tipo di piastra (96-well corning flat-bottom) e aggiungere i canali (canali a campo chiaro e canali EGFP).
   5. Regola il layout. Vai alla selezione Layout, quindi seleziona Traccia e regola i parametri (prima immagine a 1 μm, il numero di piani è 10, la distanza è 1 μm).
   6. Selezionare uno dei pozzetti di trattamento e un campo di acquisizione e premere Test per verificare se le immagini sono soddisfacenti nella sezione Esegui esperimento.
   7. Se le immagini sono soddisfacenti, tornare alla sezione Impostazione e premere l'icona Ripristina alla fine della schermata. Quindi, selezionare tutti i pozzetti di destinazione e un numero adeguato di campi di acquisizione.
   8. Vai di nuovo su Esegui esperimento e inserisci il nome della targa, quindi premi Avvia per iniziare l'elaborazione.
   9. Per misurare l'intensità della fluorescenza, vai alla sezione di analisi dell'immagine e inserisci l'immagine. Trova la cella scegliendo il canale EGFP e il metodo B. Regola la soglia comune a 0,5, l'area a >200 μm², il fattore di divisione a 3,0, la soglia individuale a 0,18 e il contrasto a più di 0,18. Quindi, calcola le proprietà dell'intensità e scegli la media come output. Premere l'icona Applica per salvare la configurazione.
   10. Vai alla sezione Valutazione per misurare l'intensità ottenendo una mappa di calore e una tabella dati. Impostare il parametro Readout su Celle - Intensità Cella EGFP Media - Media per pozzetto e avviare la valutazione.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   11. Per estrarre i dati da Operetta, fare clic sul pulsante Impostazioni e scegliere Gestione dati.
   12. Scegliere Scrivi archivio, quindi aprire la schermata di ricerca e selezionare il file.
   13. Per selezionare il file, fare clic sul piccolo segnale + nell'angolo sinistro, quindi fare clic su Misurazione e scegliere Nome piastra.
   14. Selezionare il file e fare clic su OK.
   15. Selezionare il percorso in cui salvare il file facendo clic sul segnale Sfoglia in corrispondenza del percorso attivo.
   16. Fare clic su Avvia per salvare il file di dati.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Analisi statistica della fluorescenza FITC-destrano di C. elegans
   1. Importa i dati e calcola la media e la deviazione standard (SD) utilizzando un software di statistica.
   2. Analizza la differenza significativa con l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey.

Risultati

Figura 1: L'effetto del DIM sulla permeabilità intestinale di P. aeruginosa nutrita con C. elegans.Immagini al microscopio di vermi di (A) E. coli OP50 senza alimentazione FITC-destrano, (B) E. coli con alimentazione FITC-destrano, (C) P. aeruginos...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3,3'-diindolilmetano	Sigma	D9568
90×15 mm Piastre di Petri	SPL Life Sciences, Corea del Sud	Codice 10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	CODICE 214010
Soluzione di formaldeide	sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)		Tipo selvatico
Colesterolo	sigma	Visualizzazione del materiale C3045
Corning Incorporated	CODICE 3631
dimetil solfossido	sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)
Isotiocianato di fluoresceina - destrano	sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		versione 3.5
Solfato di magnesio eptaidrato	Fisher Bioreagenti	BP2213-1
Fluoromount mezzo di montaggio acquoso	sigma	F4680
Operetta CLS Sistema di analisi ad alto contenuto	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Collezione coreana per la cultura dei tipi	KCTC N. 1637
Cloruro di sodio	Fisher Bioreagenti	BP358-1
Stereomicroscopio	Nikon, Giappone	SMZ800N