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Il seguente protocollo è un estratto da Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).
1. Assemblaggio RNP
- Progetta l'esperimento con largo anticipo, acquisendo in anticipo tutti i componenti di RNA, DNA e proteine. Come primo passaggio, provare uno dei controlli positivi elencati nella Tabella 1 e utilizzare i reagenti commerciali descritti nella Tabella dei materiali per garantire un disegno sperimentale affidabile e l'integrità dei materiali. Per ulteriori suggerimenti sulla pianificazione di un nuovo esperimento di editing del genoma, vedere gli articoli su questo argomento.
NOTA: Una volta assemblati come descritto nei passaggi successivi, gli RNP preparati in anticipo possono essere conservati a -80 °C.
- Dopo aver scelto quale gene prendere di mira, utilizza uno degli strumenti online gratuiti per progettare un gRNA ottimale. Assicurati di mirare a un esone se speri di generare un knockout.
NOTA: Questi strumenti aiuteranno a identificare un sito bersaglio con una sequenza PAM adiacente di S. pyogenes, un punteggio di alta qualità e un basso punteggio fuori bersaglio.
- Purificare la proteina Cas9 di S. pyogenes attraverso metodi pubblicati o acquistarla da un fornitore commerciale.
- Preparare un tipico tampone Cas9 per la diluizione dell'RNA, la preparazione dell'RNP e la conservazione delle proteine, che contiene 20 mM di HEPES pH 7,5, 150 mM di KCl, 10% di glicerolo e 1 mM di TCEP. Utilizzare sempre acqua priva di nucleasi in tamponi che verranno utilizzati per risospendere o diluire l'RNA per prevenire la degradazione.
- Produrre l'RNA guida (tracrRNA e crRNA o sgRNA) attraverso una trascrizione in vitro utilizzando metodi pubblicati, oppure acquistarlo da un'azienda di sintesi di acidi nucleici.
- Se inserisci un gene, sintetizza o acquista un modello di DNA di donatore.
- Conservare le aliquote di proteine e RNA a -80 °C e scongelarle con ghiaccio immediatamente prima dell'uso.
NOTA: Ogni congelamento-disgelo riduce leggermente l'efficienza. Protocolli dettagliati e ad accesso aperto per la purificazione di Cas9 e la trascrizione in vitro di sgRNA sono disponibili altrove.
- Preparazione dell'RNP per l'editing di C. elegans: assemblare il complesso RNP aggiungendo i seguenti reagenti al fine di creare un volume finale di 20 μL (le concentrazioni finali sono indicate tra parentesi): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), e i modelli di riparazione, se necessario (0,5 μM di ssDNA o fino a 350 ng/μL di dsDNA).
NOTA: L'efficienza di una riparazione DSB-template mediata da Cas9 è proporzionale alla concentrazione del costrutto di riparazione del dsDNA; Pertanto, maggiore è la concentrazione del modello di riparazione, più efficiente è la riparazione del modello. Tuttavia, è stato dimostrato che un'iniezione di miscele contenenti più di 350 ng/μL di dsDNA riduce la vitalità dei vermi iniettati. Pertanto, è meglio utilizzare fino a 350 ng/μL di dsDNA nella miscela per massimizzare l'efficienza di riparazione e minimizzarne la letalità.
- Aggiungere più crRNA per colpire più loci contemporaneamente, se necessario per l'approccio di screening co-CRISPR/co-conversione. Quando si aggiunge più di un crRNA, aggiungerlo in sequenza alla miscela master.
NOTA: La quantità di ogni crRNA non deve essere la stessa, e anche raddoppiando la concentrazione totale di crRNA nel master mix senza cambiare la concentrazione di Cas9 non sembra interferire con la frequenza della mutagenesi in un locus specifico. Gli esempi sono descritti in dettaglio in Paix et al.
- Miscelare pipettando e centrifugare la soluzione RNP a 16.000 x g per 5 s per assicurarsi che la soluzione venga raccolta sul fondo della provetta.
- Incubare la soluzione a 37 °C per 15 m.
- Centrifugare il campione a 16.000 x g per 1 minuto per pellettare eventuali particelle che potrebbero ostruire l'ago per microiniezione a foro sottile. Utilizzare il surnatante nei passaggi successivi.
- C. elegans Preparazione
1. 1 giorno prima della microiniezione: Prepara i tamponi di agarosio per la microiniezione.
- Preparare una soluzione di agarosio al 3% (p/v) in acqua aggiungendo agarosio all'acqua e portando la soluzione a ebollizione su una piastra calda o in un forno a microonde.
- Disporre i vetrini di copertura da 24 mm x 50 mm x 1,5 mm su un tavolo e utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per posizionare una piccola goccia (~15 μL) di soluzione di agarosio sul vetrino. Appiattire rapidamente la goccia di agarosio posizionando sopra un altro vetrino coprioggetti. Lasciare solidificare l'agarosio e poi rimuovere uno dei vetrini.
- Lasciare asciugare il vetrino coprioggetti rivestito di agarosio a faccia in su su un tavolo durante la notte. Dopo 24 ore, conservare i tamponi di agarosio in un contenitore pulito e asciutto.
NOTA: Questi possono essere utilizzati a tempo indeterminato.
2. Tirare gli aghi per microiniezione: utilizzando capillari in vetro borosilicato con filamenti (diametro esterno 1,0 mm e diametro interno 0,58 mm), tirare gli aghi basati su Mello e Fire57 e altre risorse. Gli aghi possono essere utilizzati immediatamente o possono essere conservati in un contenitore pulito e asciutto, rinforzato da supporti in argilla.
3. Per il mantenimento dei vermi, prepara un agar di terreno di crescita per nematodi (NGM) versato in piastre di Petri e macchiato con batteri OP50 (per i protocolli sul mantenimento standard di C. elegans e le ricette per i terreni di crescita, vedi Stiernagle).
4. Prepara i vermi per la microiniezione: 12-24 ore prima della microiniezione, raccogli gli ermafroditi in stadio L4 su una nuova piastra NG-agar con batteri OP50 e incubali durante la notte a 20 °C. Per ogni miscela di bersaglio/iniezione Cas9, raccogli ~30 vermi sulla piastra.
- Giorno della microiniezione: Caricare l'ago per microiniezione estratto con il surnatante della soluzione di RNP preparato al punto 1.2.
- Pipettare il surnatante del passaggio 1.2.4 in una pipetta capillare aspirata e riempire nuovamente la soluzione dalla pipetta capillare nell'ago per microiniezione preparato (generalmente con un carico inferiore a 0,1 μL).
- Monta l'ago caricato sull'apparecchio di microiniezione collegato a un micromanipolatore. Impostare la pressione dell'apparato di iniezione a 250 kPa e la pressione di bilanciamento a 25 kPa.
- Rompi la punta dell'ago caricata per generare un bordo affilato dell'ago. Posizionare un vetrino coprioggetto quadrato di 15 mm x 15 mm x 1,5 mm sulla parte superiore di un vetrino coprioggetti di 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
- Sovrapporre un bordo del vetrino coprioggetto quadrato con olio alocarbonico 700.
- Posizionare l'ago nell'olio, sul bordo del vetrino coprioggetto quadrato da 15 mm.
- Usando una mano per guidare il tavolino del microscopio e il vetrino coprioggetti, spazzolare il vetrino verso l'alto e lungo il bordo dell'ago mentre si preme il pedale/pulsante di iniezione. Rompere la punta dell'ago, aumentando il flusso del liquido fuori dall'ago. Ottenere una portata ottimale facendo fluire la miscela di iniezione lungo il bordo dell'ago, formando ~1 bolla/s.
- Conferma che i vermi L4 prelevati 12-24 ore prima della microiniezione siano giovani adulti in fase di sviluppo il giorno dell'iniezione. Raccogli i giovani vermi adulti su una piastra NG-agar priva di batteri OP50 e lasciali strisciare per 5 minuti. Ciò riduce la quantità di batteri trasferiti al tampone di iniezione, riducendo al minimo gli intasamenti dell'ago.
- Posiziona un tampone/vetrino coprioggetti per iniezione di agarosio su un cannocchiale di dissezione. Usando un piccone a vite senza fine, stendi una piccola traccia di olio alocarbonico lungo un bordo del pad.
- Usando il plettro a vite senza fine ricoperto d'olio, solleva diversi vermi dalla piastra NG-agar e nella traccia dell'olio. Con un pelo sottile attaccato a una pipetta, come una ciglia o un baffo di gatto, posiziona i vermi in parallelo, spingendo delicatamente i vermi nel tampone di agarosio. Fino a quando non si è a proprio agio con la procedura di microiniezione, montare e iniettare solo un verme alla volta.
NOTA: L'agarosio secco assorbirà l'umidità dai vermi, facendoli aderire al tampone. Di conseguenza, è necessario lavorare rapidamente poiché i vermi possono seccarsi.
- Una volta in posizione e attaccati al tampone, sovrapporre le viti senza fine con altre poche gocce di olio di alocarburi (~20 μL) dalla punta del plettro a vite senza fine.
- C. elegans Microiniezione di gonadi con RNP e cura post-iniezione
Il protocollo di microiniezione è adattato da Mello e Fire e descritto in dettaglio altrove.
- Posiziona il vetrino coprioggetti con i vermi montati sul microscopio per iniezione. A basso ingrandimento (obiettivo 5X, oculare 10X), posizionare i vermi perpendicolarmente all'ago per iniezione.
- Passare a un ingrandimento elevato (obiettivo 40X, oculare 10X), riposizionare l'ago adiacente al braccio della gonade corrispondente alla regione vicino ai nuclei nel pachitene medio-tardivo.
- Usando il micromanipolatore, muovi l'ago contro il verme, premendo leggermente la cuticola. Quindi, con una mano, picchiettare il lato del tavolino del microscopio per far oscillare l'ago attraverso la cuticola. Premere il pedale/pulsante di iniezione e riempire lentamente il braccio delle gonadi con la miscela per iniezione e rimuovere l'ago.
- Ripeti questo passaggio con l'altro braccio della gonade.
- Una volta iniettati i vermi, rimuovere il vetrino coprioggetti/tampone di agarosio e metterlo sotto un microscopio da dissezione.
- Utilizzando una pipetta capillare tirata, spostare l'olio dai vermi pipettando su di essi un tampone M9. Eseguire questo trattamento per liberare i vermi dall'agar.
- Dopo 10 minuti, quando i vermi si dimenano nel tampone, spostarli su una piastra NG-agar con batteri OP50 utilizzando la pipetta capillare tirata. Posizionare la piastra a 20 °C per 2-3 ore fino a quando i vermi si sono ripresi e si muovono.
- Una volta recuperati, trasferire singolarmente le viti senza fine su piastre NG-agar con OP50 e trasferire le piastre in un'incubatrice a 25 °C.
- Lasciare crescere i vermi iniettati con P 0 e deporre la progenie per 3 giorni. Schermare la prole F 1.
- Se si utilizza il co-CRISPR o la co-conversione, selezionare i vermi candidati per lo screening in base al fatto che abbiano o meno il fenotipo mutante del gene di riferimento. Trasferire singolarmente questi vermi marcati su nuove piastre NG-agar con OP50 e lasciare che depongano la progenie F2 a 20 °C.
NOTA: Il fenotipo utilizzato per uno screening o una selezione co-CRISPR dovrebbe fornire una stima precoce del successo dell'editing Cas9.
- Se il fenotipo co-CRISPR non è presente, microiniettare un plasmide di controllo positivo per aiutare a migliorare l'efficienza della microiniezione.
NOTA: Ad esempio, l'inclusione di un plasmide nella miscela di iniezione che codifica per MYO-2 marcato con mCherry aiuterà a valutare l'efficienza dell'iniezione. I vermi iniettati con successo con pCFJ90 avranno una certa prole con faringi fluorescenti.
- Esamina i worm F1 per la presenza delle modifiche desiderate. Prelevare la madre F1 da un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, lisarla ed esaminare il suo DNA mediante amplificazione PCR specifica per inserto, analisi della sequenza di DNA o saggio della nucleasi surveyor (CEL-1).
NOTA: Questi saggi possono essere eseguiti quando si utilizza un co-CRISPR/co-conversione o altri regimi di screening o selezione.
