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Articolo metodologico
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30 aprile 2023
Fonte: Farboud, B. et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.J. Vis. Exp. (2018).
Questo video descrive la microiniezione, un metodo comune per creare ceppi transgenici di C. elegans. Nell'esempio, vedremo la microiniezione utilizzata per introdurre un complesso di ribonucleoproteina (RNP) per l'editing genetico su basi CRISPR.
Il seguente protocollo è un estratto da Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018).
1. Assemblaggio RNP
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Tabella 1: Controlli positivi per esperimenti preliminari di editing genomico.Questa tabella mostra le informazioni chiave necessarie per eseguire un primo esperimento di editing genomico in ciascuna delle cellule e degli organismi descritti in questo protocollo. È probabile che seguendo questi parametri si ottenga un risultato positivo che può essere utilizzato per testare il protocollo o come base per .......
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti/Materiali | |||
| Oligonucleotidi del DNA | Tecnologie DNA integrate | - | IDT fornirà sequenze di DNA personalizzate, comprese quelle nella Tabella 1 |
| RNA guida | Synthego | - | Synthego fornirà sgRNA di alta qualità per S. pyogenes Cas9, inclusi sgRNA personalizzati contenenti le sequenze di targeting incluse nella Tabella 1 |
| Proteina Cas9 purificata (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | Se possibile, purificare Cas9 internamente o acquistare da strutture locali è un'opzione meno costosa |
| OP50 Escherichia coli | Centro di Genetica Caenorhabditis | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Terreno di crescita per nematodi agar in piastre di Petri | - | - | Vedi Stiernagle, T (ref. 59) |
| Capillari standard in vetro borosilicato con filamento: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Capillari in vetro borosilicato standard a canna singola: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Vetro di copertura; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Vetro di copertura; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Agarosio LE Apex | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmide | Addgene | 19327 | |
| Tubi capillari con filamento: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Piastre di Petri (100 × 15 mm) | - | ||
| 9" pipette pasteur | - | ||
| Acqua priva di nucleasi | - | ||
| Attrezzatura | |||
| MZ75 Stereomicroscopio | Leica | Fuori produzione. Il modello attuale è lo stereomicroscopio M80 | |
| Microscopio fluorescente a contrasto di fase invertito Axio Vert35 | Zeiss | Fuori produzione. Il modello attuale è l'Axio VertA.1 | |
| Estrattore per micropipette basato su laser (per il protocollo C. elegans) | Strumento Sutter | FG-P2000 | |
| Microiniettore Picoliter (per il protocollo C. elegans) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipolatore oleodinamico a joystick a tre assi | Narishige International | MO-202U | |
| Manipolatore grossolano | Narishige International | MMN-1 | |
| Puntali per pipette Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
