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Questo protocollo è un estratto da Mariol et al, Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con alta velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans, J. Vis. Exp.(2013).
1. Irradiazione UV e recupero di vermi transgenici
- Irradiazione con vermi:
- Raccogli 30-100 animali fluorescenti transgenici L4 su piastre di coltura separate (15-20 animali per piastra).
- Posizionare le piastre, senza i coperchi, in un reticolante UV. Irradiare i vermi a 0,012 J/cm2. Si noti che i ceppi sono più o meno sensibili ai raggi UV e che i risultati possono essere variabili a seconda dell'irradiatore UV utilizzato. È possibile testare un intervallo di dose compreso tra 0,010 e 0,015 J/cm2.
- Recupero dai vermi dopo l'irradiazione:
- Posizionare le piastre con vermi irradiati per una notte a 15 °C per il recupero.
- Controlla il numero di animali vivi. Nelle nostre mani, un tasso di sopravvivenza di circa l'80-90% è adattato per un'irradiazione efficiente.
- Far crescere gli animali irradiati a 15-25 °C fino a quando la progenie non ha raggiunto lo stadio di sviluppo, consentendo l'osservazione dell'espressione del marcatore di coiniezione.
2. Isolamento di linee transgeniche integrate
- Selezione di animali F1:
- Singoli 150-200 animali F1 fluorescenti su piastre di coltura separate. Per linee altamente trasmittenti (≥80%), sono sufficienti 100 animali F1.
- Conservare queste piastre F1 a 15-25 °C fino a quando la progenie non raggiunge uno stadio appropriato per l'osservazione di animali fluorescenti F2.
- Scartare tutte le piastre F1 che presentano i) nessuna progenie, indicando che l'animale F1 era sterile o è morto, o ii) nessun animale F2 fluorescente o solo pochi animali, indicando che l'animale F1 non ha trasmesso il transgene alla velocità prevista. Questo passaggio è rapido e rappresenta un reale vantaggio rispetto al protocollo standard che richiede una stima della percentuale di vermi F2 fluorescenti per selezionare piastre F1 che presentano ≥75% di progenie fluorescente (Tabella 1).
- Selezione di animali F2:
- Singoli quattro animali F2 transgenici fluorescenti da ciascuna piastra F1 selezionata. Quando si utilizzano transgeni fluorescenti (ad esempio mCherry, gfp o dsRed), scegliere vermi F2 con un alto livello di fluorescenza in quanto ciò potrebbe indicare che questi animali sono omozigoti per l'array integrato. Si noti che quando si scelgono animali F2 è fondamentale non portare con sé uova o larve, al fine di evitare falsi negativi nel passaggio successivo.
- Alleva animali F2 a 15-25 °C.
- Isolamento e validazione di ceppi transgenici integrati:
- Piastre F2 per vermi F3 transgenici fluorescenti al 100%. Lo schermo è abbastanza rapido in quanto la presenza di un singolo verme non fluorescente indica che la lastra deve essere gettata via. Un animale omozigote F2 per il transgene integrato darà una progenie fluorescente omozigote al 100%.
- Estrarre otto animali F3 fluorescenti da piastre selezionate per confermare l'ereditarietà del 100% del transgene. In teoria, scegliere un animale è sufficiente in questa fase. Tuttavia, la selezione di otto animali fluorescenti F3 può essere necessaria per evitare di selezionare animali non fertili o malsani, poiché l'irradiazione può indurre casualmente mutazioni che influenzano geni importanti per la fisiologia dei vermi.
- Se possibile, mantenere diversi ceppi transgenici integrati indipendenti, cioè ceppi recuperati da diversi animali F1.
