Nuovo saggio di immersione in vasca: un metodo per studiare le risposte innate allo stress nel pesce zebra

Abstract

Fonte: Chin J.S.R., et al. Approcci comportamentali allo studio dello stress innato nel pesce zebra. J. Vis. Exp. (2019)

L'articolo descrive un metodo comportamentale per valutare lo stress nel pesce zebra. In risposta allo stress, il pesce zebra tende a nuotare sul fondo di una vasca fino a quando lo stress non viene rimosso. Il protocollo di esempio descrive il metodo graduale per l'esecuzione del saggio.

Protocollo

1. Nuova configurazione del test del serbatoio

1. Preparare un becher da 250 ml pre-riempito con acqua del sistema per pesci e almeno due serbatoi di contenimento.
2. La mattina del test, trasferire almeno 10 pesci zebra adulti da utilizzare per ogni condizione sperimentale (controlli e adulti sperimentali) dalla struttura ittica in una vasca di contenimento, trasferirli nella sala comportamentale e lasciarli acclimatare per almeno un'ora><. nota: Un'analisi di potenza dovrebbe essere eseguita prima della sperimentazione, ma nelle nostre mani, un n = 10 è solitamente sufficiente per rilevare la significatività statistica. Inoltre, il serbatoio di contenimento non deve contenere più di cinque individui per litro d'acqua. Un'acclimatazione di un'ora è sufficiente poiché è stato dimostrato che gli adulti di zebrafish si abituano entro 30 minuti da una nuova vasca. Inoltre, i ritmi comportamentali sono influenzati dai processi circadiani, e quindi le repliche sperimentali eseguite in giorni diversi dovrebbero essere eseguite entro le stesse ore. In genere eseguiamo tutti gli esperimenti tra le 11:00 e le 18:00.
3. Etichettare le vasche in modo tale che la condizione o il genotipo degli animali siano ciechi allo sperimentatore.
   nota: Gli esperimenti possono essere facilmente accecati per lo sperimentatore etichettando i serbatoi utilizzando un sistema di lettere o numeri (ad esempio, un serbatoio è etichettato come "A", un altro "B", ecc.). Una parte non coinvolta negli esperimenti etichetta i serbatoi con un tale sistema e maschera le identità dello sperimentatore fino a quando la post-analisi non è completa.
4. Utilizzando una rete, posizionare delicatamente un singolo adulto nel bicchiere preriempito del passaggio 1.1. Lasciare acclimatare il pesce adulto nel becher per 10 minuti.
   nota: Registra il sesso dell'adulto, poiché potrebbe essere importante dopo l'analisi cercare differenze specifiche per sesso.
5. Dopo l'acclimatazione nel becher, introdurre il pesce nella nuova vasca (impostare i dettagli di seguito) versando delicatamente l'acqua e l'adulto dal becher.
   nota: I passaggi di questa sezione descrivono l'impostazione del nuovo saggio in vasca. Un diagramma del prodotto finale è riportato nella Figura 1B.
   1. Posiziona il nuovo serbatoio al centro del tavolo.
   2. Posizionare le luci a infrarossi dietro il serbatoio e posizionare la lastra acrilica bianca o lo schermo diffusore tra il serbatoio e la sorgente luminosa a LED.
   3. Posiziona il diffusore in modo che diffonda al massimo la luce proveniente dai LED e l'intensità della luce sia sufficiente per illuminare il nuovo serbatoio. Più la scheda è vicina alla fonte di luce, più luminose saranno le luci, ma meno si diffonderanno. Al contrario, posizionare il pannello diffusore lontano dalla sorgente luminosa ridurrà l'intensità della luce, ma diffonderà meglio la luce.
   4. Riempire circa tre quarti della nuova vasca con acqua del sistema per pesci.
      nota: L'acqua del sistema viene generata utilizzando l'osmosi inversa dell'acqua del rubinetto, seguita da un dosaggio tale che la conducibilità sia pari a 900 ± 100 μS, che il pH sia neutro (7,2) e che la temperatura sia di 27 ± 1 °C.
   5. Fissare la fotocamera al supporto della fotocamera e collegare la fotocamera al computer. Apri il software di acquisizione video e regola la telecamera in modo che sia rivolta verso la parte anteriore del serbatoio e assicurati che l'intero nuovo serbatoio possa essere visto e che non ci siano aree oscurate nel video. Regolare il serbatoio e le luci a infrarossi in modo che vi sia un'illuminazione sufficiente e uniforme in tutto il serbatoio quando osservato attraverso la telecamera.
      nota: Prima di procedere agli esperimenti, spesso può essere utile eseguire una corsa di prova, in cui viene catturato il video di un pesce e viene eseguito il tracciamento. Ciò garantirà che la configurazione sia sufficiente per la sperimentazione del comportamento.
6. Dopo aver introdotto l'adulto nella nuova vasca, avviare la registrazione della telecamera e allontanarsi dalla configurazione per evitare ulteriori disagi per i pesci.
7. Al termine della registrazione, rimuovere l'individuo dal nuovo serbatoio e posizionarlo in un nuovo serbatoio di contenimento.
   nota: È necessario utilizzare un serbatoio di contenimento diverso da quello del passaggio 1.2 per evitare test ripetuti sugli stessi individui.

Risultati

Figura 1. Schema della nuova configurazione del carro armato.(A) Dimensioni del nuovo serbatoio trapezoidale da 1,8 L visto dal lato di registrazione del serbatoio. (B) Diagramma dell'installazione, comprese le posizioni delle luci a infrarossi, della telecamera e delle barriere utilizzate per ridurre al minimo l'interferenza umana.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
macchina fotografica			Utilizziamo la fotocamera USB Point Grey Grasshopper3 con obiettivo di Edmund Optics.
Filtro a infrarossi	Edmund Optics
Programma di acquisizione video			Usa programmi come Virtualdub o FlyCapture perché il framerate di acquisizione può essere impostato.
Luci LED a infrarossi
Serbatoio di saggio	Acquaree	Codice ZT180	Dimensioni: M3 1,8 litri
Supporto e morsetto, o treppiede standard per fotocamera
Bicchiere da 250 ml
Software di tracciamento			Utilizziamo Ethovision XT 13 di Noldus Information Technology