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1. Generazione di mammosfere primarie da linee cellulari di cancro al seno umano
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa di coltura sterile.
- Preparare i terreni mammosphere contenenti DMEM/F12 integrati con 2 mM di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina, 100 U/ml di streptomicina. Preparare il terreno completo immediatamente prima dell'uso aggiungendo 20 ng/ml di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF; Sigma), 10 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti basici umani ricombinanti (bFGF; R&D Systems) e 1x supplemento B27.
- Aspirare il terreno dal pallone contenente cellule aderenti MCF-7 o MDA-MB-231 (o una linea cellulare di cancro al seno a scelta; confluenza del 70-80%), lavare due volte in 1x PBS e tripsinizzare le cellule.
- Centrifugare le celle a 200 x g a temperatura ambiente per 5 minuti. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 1-5 ml di terreno mammosferico. Pipettare su e giù e, se necessario, utilizzare un filtro con tappo del filtro cellulare da 40 μm per ottenere una sospensione a singola cellula. Utilizzare un emocitometro per assicurarsi che si sia formata una singola sospensione cellulare (in caso contrario, utilizzare un ago da 25 G per siringare la sospensione cellulare fino a 3 volte).
- Se necessario, isolare il sottogruppo cellulare CD44+CD24- tramite FACS utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD24-ficoeritrina (PE) e anti-CD44-fluoresceina isotiocianato (FITC)9. In alternativa, isolare tale popolazione utilizzando un sistema di smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS) con microsfere combinate anti-CD44 e anti-CD24-biotina secondo le istruzioni del produttore. Eseguire la selezione positiva utilizzando le colonne LS e la selezione negativa utilizzando le colonne LD e confermare i fenotipi di tutte le cellule isolate mediante citometria a flusso.
- Calcolare il numero di cellule vitali per ml utilizzando il trypan blue.
nota: La vitalità cellulare è calcolata come il numero di cellule vitali diviso per il numero totale di cellule all'interno delle griglie sull'emocitometro. Le cellule che assorbono il blu di tripano sono considerate non vitali. La seguente procedura viene utilizzata per determinare con precisione la proporzione di cellule vitali.
- Preparare una soluzione allo 0,4% di blu di tripano in PBS. Aggiungere 0,1 ml di soluzione madre di trypan blue a 1 ml di cellule. Caricare un emocitometro ed esaminare immediatamente al microscopio a basso ingrandimento. Contare il numero di cellule totali e il numero di cellule di colorazione blu. Celle vitali = [1.00 – (Numero di celle blu ÷ Numero di celle totali)] × 100.
- Per calcolare il numero di cellule vitali per ml di coltura, utilizzare la formula seguente. Ricordarsi di correggere il fattore di diluizione.
Numero di cellule vitali × 104 × 1,1 = cellule/ml di coltura
- Risospendere una quantità predeterminata di cellule in 2 ml di terreno mammostatico completo in ciascun pozzetto di una piastra a bassissimo aderenza a 6 pozzetti. La densità di semina è normalmente di 500-4.000 cellule/cm2 cella per pozzetto. Opzionalmente, utilizzare piastre a 24 pozzetti a basso attacco durante la semina di cellule alla stessa densità in 0,5 ml di terreno.
nota: Si consiglia di ottimizzare la densità di semina e il tempo di coltura per ogni linea cellulare di interesse.
- Incubare piastre a 6 pozzetti a bassissimo attacco a 37 °C e 5% di CO2 per 5-10 giorni (a seconda della linea cellulare e delle dimensioni delle mammosfere) senza disturbare le piastre, in particolare durante la fase di crescita dei primi 5 giorni.