Trasduzione per marcare le cellule tumorali PDX: introduzione del marcatore fluorescente che esprime lentivirus nella cellula tumorale in vitro

In questo articolo

Abstract

Fonte: Hanna, C., et al. Etichettatura di xenotrapianti derivati da pazienti con cancro al seno con reporter tracciabili per studi sulla crescita tumorale e sulle metastasi. J. Vis. Exp. (2016).

Il seguente video descrive una tecnica di trasduzione per marcare (xenotrapianti derivati da pazienti) le cellule tumorali PDX, che viene utilizzata per introdurre lentivirus che esprimono la proteina fluorescente verde e i reporter della luciferasi nella cellula tumorale in vitro.

Protocollo

1. Trasduzione di cellule tumorali derivate da PDX

Centrifugare le cellule tumorali dissociate a 300 g x 5 min e risospendere in 2 ml di terreno mammosferico. Contare le cellule vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano (Risospendere le cellule digerite in 5 ml di tampone di lavaggio e contare sia le cellule vitali che quelle non vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano. In breve, miscelare 50 μl di cellule e 50 μl di blu di tripano e contare il tripano-blu escluse le cellule utilizzando un emocitometro).
Preparare 10 ml di terreno mammostatico contenente 8 μg/ml di polibrene (2 μl di polibrene madre per ml di terreno).
Determinare il volume necessario per 2 x 10⁵ cellule tumorali vitali. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 2 ml di terreno contenente polibrene. Piastra 2 x 10⁵ cellule tumorali vitali per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti a bassissima aderenza.
nota: Questo è un numero ottimale di cellule necessarie per la trasduzione con un vettore lentivirale.
cautela!Le particelle lentivirali e tutti i materiali di consumo utilizzati con le particelle lentivirali devono essere maneggiati seguendo le procedure istituzionali per i rischi biologici del DNA ricombinante.
nota: La trasduzione lentivirale delle cellule mammarie primarie favorisce fortemente le cellule mioepiteliali, il che può comportare una scarsa marcatura delle cellule luminali e la selezione di sottopopolazioni di cellule tumorali durante la marcatura.
Incubare il virus con 200 mU/ml di neuraminidasi a 37 °C per 1 ora prima della trasduzione per aumentare il legame delle particelle virali a diverse sottopopolazioni di cellule primarie e correggere questa potenziale distorsione.
Aggiungere particelle lentivirali a 10 MOI (2 x 10⁶ TU per 2 x 10⁵ cellule vitali) se le cellule dissociate da PDX vengono esaurite da cellule di topo Lin+ o arricchite in cellule EpCam+. Aggiungere particelle lentivirali a 30 MOI (6 x 10⁶ TU per 2 x 10⁵ cellule vitali) se si utilizzano cellule dissociate PDX non arricchite.
nota: L'aumento del MOI consente una trasduzione efficiente anche in presenza di grandi quantità di detriti e cellule morte negli estratti grezzi. Conservarne uno con cellule non marcate per fungere da controllo della vitalità e dell'efficienza di trasduzione.
Agitare per mescolare il virus con le cellule. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per un massimo di 96 ore. Aggiungere 500 μl di terreno mammostatico fresco 24 ore dopo la trasfezione. Le cellule non si attaccano alle piastre, non aspirano i mezzi.

2. Valutazione dell'efficienza di trasduzione e del reimpianto di cellule marcate in topi immunocompromessi

Monitorare l'espressione del marcatore tracciabile (GFP) ogni 24 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10X.
nota: L'espressione di GFP può essere osservata già 24 ore dopo l'infezione, ma nella maggior parte dei PDX l'espressione di GFP è chiaramente visibile dopo 72 ore (Figura 1).
Stimare l'efficienza della trasduzione valutando la percentuale di cellule GFP+ all'interno del pozzetto totale.
nota: Poiché le colture contengono cellule tumorali, cellule stromali residue e cellule morte a vari livelli, è possibile impiantare pozzetti con un minimo del 10% di cellule GFP+ in un topo ospite.
Trasferire le cellule trasdotte da piastre a 6 pozzetti in una provetta conica da 15 ml. Aggiungere 1 ml di terreno mammostatico al pozzetto per raccogliere tutte le cellule rimaste. Mettere sul ghiaccio.
Aggiungere 10 ml di HBSS/hepes alle cellule trasdotte e centrifugare a 300 x g per 5 min, 4 °C. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere in 50 μl di estratto della matrice basale (BME) su ghiaccio.
nota: Le aliquote BME devono essere scongelate con ghiaccio, 1 - 2 ore prima dell'uso. Il BME si solidificherà a temperatura ambiente; Rimani sempre sul ghiaccio.
Caricare le cellule incorporate in BME in una siringa da insulina da 0,5 ml, tenerle in ghiaccio e portarle alla struttura per animali per il reimpianto nei topi NSG.

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Risultati

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Figura 1: Monitoraggio dell'efficienza di trasduzione in cellule PDX dissociate. A) Cellule dissociate da PDX arricchite per cellule epiteliali umane (deplezione di Lin+) 24 ore dopo la trasduzione con particelle lentivirali pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) Cellule dissociate da PDX da un esperimento separato, senza arricchimento di cellule epiteliali, 72 ore dopo la trasduzione con pHAGE-EF...