Co-coltura di cellule BC: coltura di cellule di cancro al seno con frammenti ossei per studiare la proliferazione delle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Templeton, Z. S., et al. Metodi per la coltura di espianti di tessuto femorale umano per studiare la colonizzazione cellulare del cancro al seno della nicchia metastatica. J. Vis. Exp (2015).

Questo video descrive la coltura di cellule di cancro al seno adiacenti agli espianti ossei del femore per misurare la proliferazione e la colonizzazione delle cellule tumorali in un sistema modello di espianto di tessuto osseo umano.

Protocollo

1. Co-coltura di cellule di cancro al seno adiacenti a frammenti ossei per misurare la proliferazione delle cellule mammarie utilizzando BLI

1. Prima dell'esperimento, preparare una sospensione contenente 2 x 10⁵ cellule di cancro al seno/50 μl e preparare tappi di cera ossea per immobilizzare i frammenti ossei in coltura. Tagliare il puntale di una micropipetta P200 in 3 pezzi e utilizzare l'estremità più stretta del pezzo più grande in modo "tagliabiscotti" per tagliare piccoli (~35 mg) pezzi di cera ossea. Usa l'estremità larga del pezzo più piccolo per espellere i tappi di cera d'osso in una capsula di Petri per la conservazione.
2. Posizionare un pezzo di cera d'ossa a ore 12 di ogni pozzetto e premere delicatamente con un dito indice guantato sterile.
3. Pipettare 50 μl di sospensione cellulare contenente 1 x 10⁵ cellule di cancro al seno in DMEM-10% FBS + Pen-Strep al centro di ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. (In alternativa, se lo si desidera, seminare le cellule in un modello disperso.) Posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per 45 minuti per favorire l'adesione delle cellule.
4. Posizionare 1 frammento osseo su 1 pezzo di cera ossea per ogni pozzetto sperimentale e applicare una leggera pressione con il rongeur per fissarlo. Eseguire esperimenti in triplice copia in modo tale che 3 frammenti ossei di un dato campione di THR vengano inseriti nei tre pozzetti superiori, mentre i tre pozzetti inferiori contengano cera ossea solo come controlli.
5. Utilizzando una pipetta da 5 ml, erogare delicatamente e lentamente 5 ml di DMEM-10% FBS sul lato di ciascun pozzetto per evitare di spostare le cellule mammarie o i frammenti ossei. Posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per 20-24 ore.
6. Per eseguire l'imaging a bioluminescenza (BLI), rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere il substrato di luciferina (per ottenere una concentrazione di 300 μg/ml) a ciascun pozzetto. Acquisire immediatamente l'immagine della lastra su una piattaforma di imaging IVIS utilizzando i seguenti parametri: f-stop di 1, piccolo binning, tempo di esposizione di 1 sec, livello D. Misurare l'intensità del segnale di ciascun pozzetto come la radianza media (fotoni/secondo/centimetro quadrato/steradiante).
7. Utilizza il software di imaging per definire le regioni di interesse (ROI) per quantificare la radianza media per tutti i pozzetti sperimentali e di controllo. Esporta i valori medi di radianza in un foglio Excel per eseguire statistiche e generare grafici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Tecnologie per la vita	Codice 10569-010	Integrare tutto il DMEM con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penna/streptococco
Siero fetale bovino	Tecnologie per la vita	Codice 16000-044
Penicillina Streptomicina	Tecnologie per la vita	Codice: 15140-122
D-luciferina lucciola, sale di potassio 5 g (30 mg/ml)	Tecnologie per la vita	L-8220
Cluster di colture cellulari trattate con TC a 6 pozzetti	Corning Incorporated	3516
Friedman-Pearson Rongeur	Strumenti per la scienza	Codice: 16021-14
Cera d'ossa	Società di specialità chirurgiche	903
Piattaforma di imaging IVIS 50	Calibro Life Sciences/PerkinElmer
Cellule di carcinoma mammario MCF-7	ATCC	HTB-22
Cellule di cancro al seno MDA-MB-231	ATCC	HTB-26