Iniezione intraduttale: erogazione di una miscela per iniezione nei dotti della ghiandola mammaria del topo

Abstract

Fonte: Xiang, D., et al. Modellazione del cancro al seno tramite un'iniezione intraduttale di adenovirus che esprime Cre nella ghiandola mammaria del topo. J. Vis. Exp (2019).

Questo video descrive una tecnica di iniezione intraduttale in cui forniamo una miscela per iniezione nei dotti delle ghiandole mammarie di topo.

Protocollo

1. Iniezione intraduttale

1. Utilizzare tecniche asettiche durante tutta la procedura chirurgica.
2. Praticare un'incisione sulla pelle a una lunghezza di ~1 cm tra le due quarte MG inguinali (Figura 1). Separare accuratamente il lembo cutaneo (con la MG) dal peritoneo parietale in modo da visualizzare l'albero duttale mammario.
3. Tenere con cura il capezzolo con una pinza da orologiaio e rimuovere il capezzolo esterno senza tagliare la pelle vicina, utilizzando una forbice per microdissezione.
4. Caricare ~3-5 μL di miscela per iniezione Ad-Cre in una siringa Hamilton da 25 μL con un ago con mozzo metallico da 33 G fissato. Stimare il volume della miscela iniettabile nella siringa in base al colorante blu incluso nella miscela.
   nota: Utilizzare un volume più piccolo (ad es. 3 μL) quando si inietta in MG di femmine di 3-4 settimane e un volume maggiore (ad es. 10 μL) quando si inietta in MG di femmine in allattamento.
5. Tenere delicatamente il bordo del lembo cutaneo con una pinzetta curva fine e iniettare lentamente la miscela per iniezione di Ad-Cre nel capezzolo, monitorando nel frattempo la diffusione del colorante blu nell'albero duttale mammario. Mantenere la velocità di iniezione il più bassa possibile per evitare danni al lume duttale.
   nota: Il fluido iniettato (come illustrato dal colorante blu di bromofenolo incluso) che si diffonde in tutto l'albero duttale senza fuoriuscire nel compartimento stromale indica una corretta iniezione intraduttale.
6. Estrarre delicatamente l'ago dal capezzolo per evitare perdite del fluido iniettato.
7. Esaminare il lato distale (cioè lontano dal capezzolo) della MG o l'area circostante il capezzolo iniettato. Si noti che il colorante blu gonfio (cioè il colorante che si diffonde nello stroma vicino) indica un'iniezione di cuscinetto adiposo mammario piuttosto che un'iniezione intraduttale riuscita.
8. Chiudere le ferite chirurgiche (da 1,2) nella pelle con clip per ferite.

2. Assistenza postoperatoria

1. Rimuovi il mouse dall'anestesia e posizionalo su un termoforo all'interno di una gabbia pulita per il recupero.
2. Somministrare nuovamente meloxicam per via sottocutanea alla dose di 5 mg/kg, 24 ore dopo l'intervento.
3. Monitorare le condizioni generali dell'animale e cercare segni di infezione nel sito di incisione per 5 giorni.
4. Le clip della ferita vengono rimosse ~7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.

Risultati

Figura 1: Diagramma schematico dell'iniezione intraduttale del virus Ad-Cre in una MG.(A) Sito di incisione nella linea mediana tra i due quarti MG. (B) Iniezione intraduttale di Ad-Cre con un colorante blu (per una migliore visualizzazione) in uno dei quarti MG. (C) Chiusura dell'incisione nella pelle mediante clip per ferite

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago calibro 33	Hamilton	Codice: 7803-05	Stile a punta 3 smussato
Clip reflex da 7 mm	Braintree Scientifico	RF7 CS
Adenovirus, Ad-K5-Cre	Nucleo vettoriale virale dell'Università dell'Iowa	Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
Adenovirus, Ad-K8-Cre	Nucleo vettoriale virale dell'Università dell'Iowa	Ad5mK8-nlsCre
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Siringa di Hamilton	Hamilton	7636-01	0,025 ml
Forbici per micro-dissezione	Pentair	9 milioni	Pinze da orologiaio
Pinzette per micro-dissezione	Dumont	M5