Terreno condizionato dall'organo: terreno di generazione da cellule d'organo prelevate per studi sul cancro metastatico

Abstract

Fonte: Piaseczny, M. M., et al. Generazione di terreni condizionati da organi e applicazioni per lo studio delle influenze organo-specifiche sul comportamento metastatico del cancro al seno. J. Vis. Exp.(2016).

Questo video descrive un metodo per generare un mezzo condizionato all'organo derivato dal fegato del topo. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e studiare fattori solubili derivati da organi e i loro effetti sul tropismo degli organi e sul comportamento metastatico delle cellule tumorali.

Protocollo

1. Generazione di mezzi condizionati al polmone e al cervello

1. In una cappa di coltura tissutale sterile, capovolgere tre volte le provette di PBS contenenti polmone o cervello per rimuovere il sangue residuo dagli organi e aspirare il sangue contenente PBS. Ripetere con PBS fresco freddo fino a quando la soluzione appare limpida senza segni di sangue.
2. Collocare i polmoni e il cervello in piastre di Petri di vetro separate da 60 mm2. Utilizzando due lame di bisturi sterili, tritare i polmoni o il cervello tagliando ripetutamente avanti e indietro fino a quando i frammenti di tessuto non raggiungono una dimensione di circa ~ 1 mm3.
3. Determinare la quantità di terreno necessaria per risospendere i frammenti di tessuto dalla differenza di peso calcolata.
   nota: Il peso del polmone e del tessuto cerebrale viene normalizzato mediante risospensione in un rapporto media:tessuto (vol/wt) di 4:1.
4. Risospendere i frammenti di tessuto in un volume appropriato (determinato in precedenza al punto 1.3) del terreno di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM):F12 integrato con 1 integratore concentrato di mitogeno e penicillina (50 μg/ml)/streptomicina (50 μg/ml).
5. Aggiungere frammenti di tessuto polmonare o cerebrale risoluti a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
6. Incubare i frammenti di tessuto in terreno per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo l'incubazione, raccogliere i terreni condizionati per ciascun tessuto e diluire ulteriormente aggiungendo tre volumi equivalenti di terreno fresco in una provetta conica da 50 ml.
7. Centrifugare a 1.000 x g in terreno condizionato diluito per ciascun organo a 4 °C per 15 minuti per rimuovere i detriti di tessuto di grandi dimensioni. Raccogliere il surnatante del terreno e filtrarlo attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
8. Pool di terreni condizionati da ciascun organo (ad esempio, polmone con polmone e cervello con cervello) da più topi per tenere conto della variabilità da topo a topo. Aliquotare e conservare il fluido condizionato a -80 °C fino al momento dell'uso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x soluzione salina tamponata con fosfato	ThermoFisher Scientifico	Codice 10010-023	Mantieni sterile
Piastre di Petri in vetro da 60 mm2	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Mantieni sterile
DMEM:F12	Tecnologie per la vita	Codice 21331-020	Scaldare in bagnomaria a 37 °C prima dell'uso, conservare sterile
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Tecnologie per la vita	Codice: 15140-122	Mantieni sterile
Tubi conici da 50 ml	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Mantieni sterile
Filtri per siringhe da 0,22 μm	Sigma-Aldrich	Z359904	Mantieni sterile
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Mantieni sterile
Lame per bisturi	Fisher Scientifico	S95937A	Mantieni sterile