$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Convalida delle metastasi polmonari utilizzando l'inchiostro di china Inflazione dei polmoni portatori di tumore
NOTA: Per convalidare i risultati dell'imaging del tumore in tempo reale con luciferasi, eseguire il gonfiaggio con inchiostro di china dei polmoni di topo portatori di tumore per quantificare i noduli tumorali. Le cellule 4T1 metastatizzano anche in altri organi e tessuti (Figura 1) e quindi, se necessario, dovrebbe essere eseguito l'esame istologico di questi organi per convalidare le metastasi tumorali. Questo protocollo utilizza le metastasi polmonari come esempio.
- Tieni i topi nella loro gabbia domestica esistente per l'eutanasia. Se alloggiati con altri animali, trasferisci i topi che non vengono soppressi in una gabbia diversa.
- Rimuovere la parte superiore del filtro a gabbia e sostituirla con la parte superiore del filtro CO2. Accendere la bombola di gas CO2 compresso (100%) collegata alla parte superiore del filtro CO2. Impostare la portata a 2 L/min e mantenere la CO2 accesa per almeno 10 minuti. Se i topi respirano ancora alla fine dei 10 minuti, lasciare la CO2 accesa fino ad almeno 1 minuto dopo che i topi hanno smesso di respirare. Spegnere il controllo della bombola di CO2 e il flussometro. Attendere altri 3 minuti e rimuovere la parte superiore del filtro.
- Posiziona il topo sacrificato sulla schiena su una tavola di polistirolo. Fissare le gambe per garantire un accesso senza ostacoli alla trachea. Spruzza i topi con etanolo al 70%.
- Usando un paio di forbici, taglia lungo la linea mediana dell'addome medio del topo attraverso la gabbia toracica e fino verso le ghiandole salivari. Osservare la trachea. Usa una pinza per rimuovere i tessuti che circondano la trachea per esporre la trachea.
- Infilare un puntale per pipetta sotto la trachea. Tenendo la punta con una mano, sollevare delicatamente la trachea verso l'alto e allontanarla dal corpo.
- Ruota la piattaforma tenendo premuto il mouse di 180°. Utilizzare una siringa di tubercolina da 1/2 CC 27 G 1/2 per iniettare l'inchiostro di china (10% di inchiostro di china e 0,1% di idrossido di ammonio) nei polmoni attraverso la trachea. Gonfiare completamente i polmoni con l'inchiostro fino a quando non si avverte una forte resistenza.
- Usa un paio di forbici per tagliare la trachea. Usa una pinza per tenere il mouse e inserisci un'altra serie di pinze sotto i polmoni ed estrai i lobi polmonari dal mouse. Sciacquare brevemente i polmoni in un becher contenente acqua.
- In una cappa chimica, trasferire i polmoni in una fiala di vetro a scintillazione contenente 3 ml di soluzione di Fekete (50% etanolo, 6% formaldeide e 3% acido acetico glaciale). Tappare il flaconcino per evitare che la soluzione evapori.
nota: I fazzoletti possono essere conservati nella soluzione di Fekete a tempo indeterminato.
- Dopo alcuni minuti, osservare i noduli tumorali come punti bianchi sui polmoni neri (Figura 1). Il nodulo tumorale bianco è visibile con gli occhi. Trasferisci i polmoni in un piatto in una cappa aspirante e conta il numero di macchie bianche. Ogni macchia bianca rappresenta un singolo nodulo tumorale metastatico.
