Dissociazione meccanica: un metodo per ottenere cellule vitali da un tessuto

Abstract

Fonte: Garaud et. al., Un protocollo semplice e rapido per dissociare in modo non enzimatico tessuti umani freschi per l'analisi dei linfociti infiltranti. J. Vis. Exp. (2014).

Questo video descrive la dissociazione non enzimatica di tessuto umano fresco per ottenere cellule vitali. La tecnica viene utilizzata per l'analisi qualitativa e quantitativa delle cellule CD45 positive (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni.

Protocollo

1. Preparazione dell'omogeneizzato tissutale

1. I tessuti dissezionati (tessuto maligno e normale resecato dalla sala operatoria) vengono sottoposti al laboratorio di patologia da personale addestrato per il prelievo immediato. Tumore, NANT (prelevato alla massima distanza possibile dal tumore) e frammenti di tessuto normale vengono processati di routine entro 1-3 ore dall'escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando procedure standard di biosicurezza per i tessuti umani. Un diagramma di flusso del protocollo è illustrato nella Figura 1.
2. Pesare tutti i frammenti di tessuto (normale, NANT e tumorale) e misurare la lunghez....

Risultati

Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo.Vengono mostrate la nostra procedura per il trattamento di tessuti umani freschi e alcuni approcci analitici che possono essere successivamente utilizzati per valutare i linfociti che si infiltrano nei tessuti umani.

Figura 2: Immagine colorata H&E di un.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dissociatore GentleMacs	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine è in qualche modo equivalente
Centrifuga 5810 R	Eppendorf		o altra centrifuga da tavolo standard
Centrifuga 5417 R	Eppendorf		o altra microcentrifuga standard
Esco Classe II A2 Cabina di Biosicurezza	ESCO globale		o altra cappa BSL2 standard
Microscopio invertito	Nikon eclissi TS100		o altro microscopio compatibile per un ematocitometro
Camera Bürker Marienfield		Codice 640210	o altro ematocitometro standard
Citometro a flusso Navios	Beckman Coulter		o altro citometro a flusso (consigliato 8-10 colori)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine utilizza Filcon
Piatto per coltura cellulare	Sarstedt	72.710	o altro materiale plastico apirogeno
Bisturi usa e getta	Swann-Morton	510	o bisturi sterile monouso standard
Filtro cellulare BD 40 μm	Becton Dickinson	734-0002	o altro materiale plastico apirogeno
BD Falcon Tubo 50 ml	Becton Dickinson	Codice 352070	o altro materiale plastico apirogeno
BD Falcon Tubo 15 ml	Becton Dickinson	352097	o altro materiale plastico apirogeno
BD FACS Tubo 5 ml	Becton Dickinson	352008	o altro materiale plastico apirogeno
Pipetta sterile Pasteur 5 ml	VWR	612-1685	o altro materiale plastico apirogeno
Microfuge Tubo 1,5 ml	Eppendorf	7805-00	o altro materiale plastico apirogeno
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	Si consiglia un terreno privo di siero
Soluzione salina tamponata con fosfato	Lonza	BE17-516F	PBS fisiologico standard
Tripan blu	VWR	Codice: 17942E	o altra macchia vitale