1. Preparazione dell'omogeneizzato tissutale
- I tessuti dissezionati (tessuto maligno e normale resecato dalla sala operatoria) vengono sottoposti al laboratorio di patologia da personale addestrato per il prelievo immediato. Tumore, NANT (prelevato alla massima distanza possibile dal tumore) e frammenti di tessuto normale vengono processati di routine entro 1-3 ore dall'escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando procedure standard di biosicurezza per i tessuti umani. Un diagramma di flusso del protocollo è illustrato nella Figura 1.
- Pesare tutti i frammenti di tessuto (normale, NANT e tumorale) e misurare la lunghezza, la larghezza e l'altezza (lunghezza x larghezza x altezza). Questo è un passo importante per la successiva normalizzazione delle sottopopolazioni cellulari, dell'RNA estratto, ecc.
nota: L'intervallo di dimensioni del campione è compreso tra 100 e 10.000 mm3 senza grasso, se possibile.
- Imprimere il frammento tumorale su un vetrino per la colorazione H&E per verificare che il tessuto faccia effettivamente parte del tumore.
- Fallo premendo un vetrino da microscopio sul frammento tumorale e applicando una leggera pressione con le dita per alcuni secondi.
- Fissare il vetrino con isopropanolo per 2 minuti seguito da una fase di lavaggio in acqua. Controcolorare il tessuto per 30 secondi con ematossilina di Mayer.
- Lavare lo scivolo in sei bagni d'acqua. Colorare in Floxina B 2% per 15 sec.
- Lavare in un bagno d'acqua seguito da quattro bagni di isopropanolo e terminare con un bagno d'acqua.
- Incubare in isopropanolo per 1 minuto e scolare. Limpido in due bagni di xilene.
- Montare con mezzo di montaggio a base di xilene. Esaminare la cellularità tumorale (Figura 2).
nota: Principalmente, le cellule tumorali si attaccano al vetrino imprintato: le cellule stromali, linfoidi o adipose raramente rimangono, lasciando spazi tra le cellule tumorali (Figura 2).
- Porre il frammento di tessuto in un piccolo piatto di coltura contenente 1 ml di terreno di coltura di cellule ematopoietiche chimicamente definito e privo di siero (di seguito denominato terreno) a temperatura ambiente e tagliarlo in piccoli pezzi (~1 - 2 mm2) utilizzando un bisturi sterile.
- Trasferire il tutto (frammenti di tessuto + terreno) in una provetta C con dissociatore meccanico.
- Sciacquare la capsula di Petri e il bisturi con 2 ml di terreno utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungerlo alla provetta C (volume di terreno per la dissociazione = 3 ml).
- Utilizzare il programma di dissociazione meccanica A.01 per provette C (il programma più delicato) per omogeneizzare i frammenti di tessuto in una sospensione a singola cellula. Posizionare il tubo C nell'apparecchio ed eseguire il programma due volte di seguito (un ciclo = 25 sec).
nota: Questa procedura di omogeneizzazione è stata stabilita e convalidata per il tessuto mammario umano, altri tipi di tumore o tessuto potrebbero dover utilizzare un programma diverso e dovrebbero essere testati per primi.
- Rimuovere la provetta C dall'apparecchio e travasare l'omogeneizzato direttamente in un filtro cellulare da 40 μm posizionato su una provetta da 50 ml. Utilizzando la stessa pipetta Pasteur del passaggio 1.6, trasferire il liquido rimasto nella provetta C nel filtro cellulare.
- Trasferire il liquido filtrato in una provetta da 15 ml utilizzando un puntale per micropipetta da 1 ml. Conservare temporaneamente il filtro cellulare e la sua provetta da 50 ml.
- Sciacquare la provetta C con altri 3 ml di terreno e trasferirla, sempre utilizzando la stessa pipetta Pasteur del passaggio 1.6, nel colino cellulare ancora posizionato sulla provetta da 50 ml. Spremere la quantità massima di liquido residuo intrappolato nel tessuto non omogeneizzato nella provetta da 50 ml muovendola delicatamente intorno al colino con una pipetta Pasteur pulita o con un puntale da 1 ml che viene successivamente gettato via per evitare di contaminare l'eluato.
- Posizionare il filtro cellulare capovolto sulla provetta C originale e risciacquare con 3 ml di terreno in modo che il tessuto non omogeneizzato ricada nella provetta C.
- Riomogeneizzare come al punto 1.7 per due cicli del programma A.01.
- Versare questo secondo omogeneizzato attraverso il colino cellulare posizionato sulla provetta da 50 ml, sciacquare nuovamente la provetta C con 3 ml di terreno (come al punto 1.10) e trasferire con la pipetta Pasteur nel colino cellulare posizionato sulla provetta da 50 ml, spremendo nuovamente la massima quantità di liquido dal tessuto connettivo residuo intrappolato nel colino cellulare.
- A questo punto, un volume di ~2,5 ml è nella provetta da 15 ml e ~9 ml nella provetta da 50 ml.
2. Separazione del surnatante tissutale e delle cellule
- Centrifugare gli omogeneizzati nelle provette da 15 ml e 50 ml per 15 minuti a 600 x g a temperatura ambiente.
- Decantare l'SN dalla provetta da 15 ml in una provetta pulita e conservare temporaneamente a 4 °C. Questo surnatante = tumore primario, NANT o SN tissutale normale (volume finale 2,5 ml) viene successivamente chiarificato e aliquotato prima della conservazione a -80 °C per analisi future (vedi sotto).
- Eliminare il surnatante dal tubo da 50 ml.
- Risospendere delicatamente entrambi i pellet cellulari in un volume finale di 1 ml di terreno. Brevemente, prima rompere delicatamente il pellet di cella in entrambe le provette (picchiettando la provetta su una superficie dura). Risospendere il pellet di cellule sciolte nel 50 ml con 500 μl di terreno e trasferire questa sospensione cellulare nella provetta da 15 ml per risospendere il secondo pellet. Ripetere questo passaggio una volta con i secondi 500 μl di terreno per il massimo recupero delle cellule.
- Trasferire 10 μl della sospensione cellulare in una piccola provetta, miscelare con 10 μl di blu di tripano (diluizione 1:1) e contare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro.
nota: A questo punto una frazione della sospensione cellulare può anche essere analizzata mediante citometria a flusso per valutare le dimensioni delle cellule, la granularità e, se lo si desidera, un numero limitato di marcatori di sottopopolazione per una valutazione più precisa della distribuzione cellulare relativa nell'omogenato prima di un'analisi o di una sperimentazione approfondita. Tutte le analisi mediante citometria a flusso incorporano la marcatura CD45 per la normalizzazione delle sottopopolazioni.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule del tumore, del NANT o del tessuto normale sono ora pronte per un'ulteriore purificazione o analisi. Questi passaggi aggiuntivi sono migliori se eseguiti lo stesso giorno dell'intervento.
nota: Per l'analisi citofluorimetrica, ma non per la selezione cellulare, i globuli rossi residui devono essere lisati dopo la marcatura degli anticorpi aggiungendo 0,4 ml di tampone di lisi dei globuli rossi al pellet cellulare, agitando immediatamente per 1 secondo e incubando per un minimo di 10 minuti a temperatura ambiente (al riparo dalla luce) prima dell'analisi.
3. Chiarificazione del surnatante tissutale
- Centrifugare le provette da 1,5 ml con SN in tessuto a 15.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Rimuovere con cautela il surnatante senza toccare o disturbare il pellet. Trasferire in una provetta (o in provette) pulite a seconda del numero e del volume di aliquote desiderate.
- Conservare il surnatante a -80 °C per un uso futuro.
