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1. Preparazione di 2-idrossietilagarosio al 3%
- In una bottiglia di vetro da 100 ml pulita e asciutta, aggiungere 0,9 g di 2-idrossietilagarosio (Agarosio VII) seguiti da 30 ml di acqua distillata.
- Cuocere il composto nel microonde per 15 secondi e agitare delicatamente. Ripetere questo passaggio almeno altre tre volte fino a quando la polvere di agarosio non si scioglie completamente.
- Autoclavare il flacone contenente la soluzione per 15 minuti.
- Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio fino a RT prima di un ulteriore utilizzo. Conservare la soluzione in RT.
2. Preparazione dello strato inferiore: gel di agarosio allo 0,6%
- Preriscaldare diverse pipette da 5 ml e 10 ml in un'incubatrice a 37 °C per evitare che l'agarosio si solidifichi nella pipetta durante la manipolazione.
- Allentare parzialmente il coperchio del flacone e cuocere nel microonde la soluzione preconfezionata di agarosio al 3% 2-idrossietilagarosio per 15 secondi. Quindi, agitare delicatamente la soluzione e cuocere nel microonde per altri 15 sec.
cautela: Prestare attenzione quando si fa roteare la soluzione di agarosio perché la soluzione sale quando esposta all'aria e può fuoriuscire.
- Se c'è del gel solido residuo nel flacone, microonde per qualche secondo in più.
- Conservare il flacone contenente la soluzione di agarosio in un bagnomaria a 45 °C durante i passaggi successivi per evitare che la soluzione di agarosio si solidifichi prematuramente.
- Caldo MCF10DCIS fluido in bagnomaria a 37 °C.
nota: MCF10DCIS terreno è costituito da DMEM/F12, 5% siero di cavallo, 5% penicillina streptomicina.
- Trasferire 3 ml della soluzione di agarosio al 3% utilizzando le pipette preriscaldate in una provetta conica sterile da 50 ml.
- Aggiungere immediatamente 12 ml di MCF10DCIS caldo e capovolgere delicatamente il tubo conico per mescolare l'agarosio con il terreno. Cerca di non formare bolle in quanto interferirà con il conteggio delle colonie in seguito.
- Aggiungere delicatamente 2 ml di questa miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti senza formare bolle d'aria.
- Incubare la piastra di coltura a 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 °C per 1 ora per consentire alla miscela di solidificarsi.
- Dopo che il composto si è solidificato, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti. Lo strato inferiore è ora pronto per l'uso.
3. Preparazione dello strato contenente cellule: gel di agarosio allo 0,3%
- Tripsinizzare MCF10DCIS cellule e diluirle a una concentrazione cellulare di 4 x 104 /ml.
- Prelevare 2 ml di agarosio al 3% utilizzando pipette preriscaldate e trasferirli in una provetta conica sterile da 50 ml.
- Aggiungere immediatamente 8 ml di MCF10DCIS terreno nel tubo conico e capovolgere delicatamente per mescolare l'agarosio con il terreno. Evitare la formazione di bolle.
- Prelevare 2 ml di cellule MCF10DCIS (4 x 104 /ml) e trattare con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
- In una diluizione 1:1, mescolare le cellule con l'agarosio allo 0,6%.
- Prelevare 1 ml della miscela di cellule e agarosio e aggiungerla delicatamente sullo strato inferiore della piastra di coltura a 6 pozzetti (2 x 104 cellule/ml).
- Posizionare la piastra di coltura a 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 °C per almeno 15 minuti per consentire allo strato superiore di solidificarsi.
- Dopo che la miscela si è solidificata, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione.
4. Preparazione dello strato di alimentazione: gel di agarosio allo 0,3%
- Microonde la soluzione preconfezionata di 2-idrossietilagarosio per 15 secondi, agitare delicatamente la soluzione e cuocere nel microonde per altri 15 secondi.
- Equilibrare il flacone della soluzione di agarosio a bagnomaria a 45 °C.
- Riscaldare il MCF10DCIS in un bagnomaria a 37 °C.
- Mescolare 1 ml di soluzione di agarosio al 3% con 9 ml di MCF10DCIS caldo in un tubo conico da 50 ml e capovolgere delicatamente per mescolare l'agarosio con il terreno. Evitare la formazione di bolle d'aria.
- Trattare la miscela con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
- Aggiungere delicatamente 1 ml di questa miscela (senza formare bolle) in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 6 pozzetti contenente il fondo e gli strati morbidi.
- Posizionare la piastra di coltura a 6 pozzetti orizzontalmente su una superficie piana a 4 °C per almeno 15 minuti per consentire alla miscela di solidificarsi.
- Dopo che lo strato di alimentazione si è solidificato, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C.
- Ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo 1 ml di agarosio allo 0,3%/soluzione di trattamento/terreno sullo strato di alimentazione esistente per rifornire le cellule con nuovi terreni fino a quando non si osserva la formazione di colonie.
nota: L'agar negli strati morbidi e di alimentazione è molto morbido e, pertanto, i nutrienti aggiunti dallo strato di alimentazione si diffonderanno prontamente nello strato contenente le cellule per raggiungere le cellule.