1. Iniezione nella vena caudale di cellule tumorali marcate
NOTA: Il passaggio 1.2.4 è stato ottimizzato per le cellule 4T1 che crescono in topi BALB/c singenici. Se vengono utilizzate altre linee cellulari tumorali e ceppi di topi, è necessario innanzitutto ottimizzare il numero di cellule iniettate e la lunghezza del test.
- Espandere le linee cellulari 4T1 generate nella fase 2 su due piastre da 15 cm in terreno di crescita completo in modo che le cellule in eccesso siano disponibili il giorno dell'iniezione.
- Preparare le cellule per l'iniezione della vena caudale come segue:
- Aspirare il terreno e sciacquare le piastre cellulari con 1x PBS.
- Tripsinizzare le cellule con 5 ml di tripsina per piastra da 15 cm per 2-5 minuti (le cellule devono sciacquare liberamente il fondo del pozzetto). Trasferire tutte le cellule in una provetta conica. Lavare le cellule rimanenti dalla piastra di coltura tissutale con una quantità sufficiente di terreno di coltura completo per estinguere la tripsina e aggiungere il lavaggio alla stessa provetta conica.
- Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatico per determinare il numero totale di celle.
- Centrifugare le cellule a 122 x g per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1x PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 2,5 x 104 cellule vengono iniettate in ciascun topo in 100 μL di PBS, quindi le cellule risolubili a 2,5 x 105 cellule/mL. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.
NOTA: è importante limitare il tempo che intercorre tra la tripsinizzazione delle cellule e l'iniezione della vena caudale a circa 1 ora.
- Iniettare le cellule 4T1 dal passaggio 1.2.5 nei topi attraverso la vena laterale della coda come segue:
- Lavorando in una cappa presso la struttura per animali, mescolare delicatamente ma accuratamente le cellule capovolgendo la provetta o utilizzando una siringa da 1 ml per assicurarsi che siano risospese uniformemente. Assicurarsi sempre che le cellule siano risospese prima di caricare la siringa.
- Caricare una siringa Luer-lock da 1 mL con sospensione cellulare ed espellere le bolle d'aria in eccesso. Posizionare un ago da 1/2 pollice calibro 30 sulla siringa con lo smusso rivolto verso l'alto ed espellere le bolle d'aria.
- Posiziona delicatamente il mouse in un sistema di ritenuta per roditori.
- Le vene laterali della coda dovrebbero essere visibili e dilatate. In caso contrario, pizzica delicatamente la base della coda e immergi la coda in acqua tiepida del rubinetto per dilatare le vene.
nota: La dilatazione delle vene può essere ottenuta anche posizionando la gabbia del mouse sotto una lampada riscaldante e/o sopra un termoforo.
- Usa una salvietta imbevuta di alcol per pulire la coda. Inserire l'ago nella vena della coda, con il lato smussato rivolto verso l'alto, e iniettare 100 μL di sospensione cellulare.
nota: Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe scivolare facilmente leggermente avanti e indietro e non dovrebbe esserci resistenza quando lo stantuffo viene spinto. Le iniezioni riuscite dovrebbero anche provocare un "vampatere" in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione.
- Rimuovere lentamente l'ago e, utilizzando una garza sterile, applicare pressione sul sito di iniezione per fermare l'eventuale sanguinamento.
- Rimetti il mouse nella sua gabbia e monitora per 15 minuti per garantire il pieno recupero. I topi devono essere controllati per segni di dolore o angoscia 3 volte alla settimana.
- Monitorare i topi per la formazione e la crescita di metastasi per 3-6 settimane (dipendenti dalla linea cellulare e dal ceppo di topo) utilizzando un dispositivo di imaging in vivo su animali vivi (vedere i passaggi 1.5 e 1.6).
