Articolo metodologico

Saggio di immunofluorescenza CTC: una tecnica per caratterizzare le cellule tumorali circolanti

30 aprile 2023

In questo articolo

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Garcia, J., et al. Caratterizzazione semi-automatica PD-L1 ed enumerazione di cellule tumorali circolanti da pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule mediante immunofluorescenza.J. Vis. Exp.(2019)

Questo video descrive il test di immunofluorescenza delle cellule tumorali circolanti (CTC), una tecnica per caratterizzare i biomarcatori sulle cellule tumorali circolanti in campioni di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule. Questo test potrebbe essere utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici del tumore e la risposta immunitaria, che possono riflettere la risposta alla chemioterapia, alle radiazioni e ai possibili trattamenti immunoterapici.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Colorazione in immunofluorescenza

  1. Enumerare su un vetrino a camera con una griglia di tipo emocitometrico il numero di cellule per mL. Diluire il campione arricchito con una soluzione antilegante allo 0,2% (Tabella dei materiali) a una concentrazione che raggiunga 100.000 cellule/100 μl per citospin.
  2. Inumidire il contorno della camera del campione utilizzando cotone (Tabella dei materiali) con 50 μl di soluzione antilegante allo 0,2%. Posizionare un vetrino in polilisina nella camera del campione e chiudere.
  3. Rivestire un puntale con una soluzione antilegante allo 0,2% pipettando su e giù 3 volte. Risospendere il campione arricchito e trasferire la soluzione cellulare nella camera del campione. Centrifuga con centrifuga dedicata (Tabella dei Materiali) a 400 giri/min per 4 min (accelerazione bassa).
  4. Posizionare un isolatore di silicio attorno all'area di deposizione. Lasciare asciugare il vetrino sotto una cabina di sicurezza microbiologica per 2 minuti.
  5. Preparare la soluzione di fissazione diluendo 1 mL di paraformaldeide al 16% (PFA) con 3 mL di PBS sterile. Aggiungere 100 μl di soluzione di fissazione (4% PFA) per campione e incubare a RT per 10 minuti. Rimuovere la soluzione di fissazione ed eseguire tre lavaggi con 200 μL di PBS e incubare a RT ciascuno per 2 min.
    ATTENZIONE: Utilizzare PFA sotto una cabina di sicurezza chimica per prevenire l'inalazione.
  6. Preparare la soluzione di saturazione diluendo il siero fetale bovino (FBS) al 5%, il reagente bloccante del recettore Fc (FcR) al 5% e l'albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS sterile (Tabella dei materiali). Aggiungere 100 μl di soluzione di saturazione per campione e incubare per 30 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di saturazione.
  7. Aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale per campione (anticorpo CD45 1/20; anticorpo PanCK 1/500; anticorpo PD-L1 1/200; Soluzione di saturazione Qsp 100 μL) (Tabella dei materiali). Posizionare il vetrino in polilisina in una piastra Petri da 100 mm x 15 mm. Inumidire una carta assorbente con 2 ml di acqua sterile e chiudere la capsula di Petri con il coperchio. Posizionare a 4 °C per una notte e proteggere dalla luce.
  8. Rimuovere la miscela di anticorpi ed eseguire 3 lavaggi con 200 μL di PBS, incubando ogni lavaggio per 2 minuti. Lasciare asciugare il campione per 5 minuti e proteggerlo dalla luce. Posizionare 10 μL di soluzione di montaggio (Tabella dei materiali) nell'area di deposizione e coprire con un vetrino coprioggetti per microscopio senza formare bolle. Sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pluronic F-68 10% Gibco Codice 24040-032Soluzione anti-legante. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
EZ Cytofunnels ThermoFisherA78710003Camera di campionamento con cotone. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Centrifuga Shandon Cytopsin4ThermoFisher A78300003Centrifuga dedicata. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Paraformaldeide 16%ThermoFisher 11490570Soluzione di fissaggio. Condizioni di conservazione: +4°C
Soluzione salina tamponata con fosfato Grado Ultra Puro 1X - 1L1° Laboratorio di BaseBUF-2040-1X1LCondizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Agente bloccante FcR Miltenyi BiotecCodice 130-059-901Condizioni di conservazione: +4°C
Anticorpo monoclonale PD-L1 (clone 29E2A3) - FicoeritrinaBioLeggenda BLE329706 Condizioni di conservazione: +4°C
Anticorpo monoclonale PanCK (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisherCodice: 53-9003-80 Condizioni di conservazione: +4°C
Anticorpo monoclonale CD45 (clone HI30) Alexa Fluor 647BioLeggenda BLE304020Condizioni di conservazione: +4°C
Montaggio fluoro sigma F4680Soluzione di montaggio. Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
PetriDutscherCodice 632180Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)OzymeBE17-512FCondizioni di conservazione: +4°C
Vetrini in polilisina ThermoFisherJ2800AMNZCondizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Isolatore al silicio Bio-Laboratori Grace Codice 664270Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Acqua deionizzata sterile – 100 mL1° Laboratorio di Base CUS-4100-100ml Condizioni di conservazione: Temperatura ambiente
Siero fetale di vitello (FCS)GibcoCodice 10270-106Condizioni di conservazione: +4°C

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

CitocentrifugazioneMicroscopia a fluorescenzaCaratterizzazione di PD L1Carcinoma polmonare non a piccole celluleFissazione cellulareMarcatura con anticorpiLavaggio con PBSSoluzione di montaggio

Articoli correlati