Inflazione dell'agarosio polmonare intero: un metodo per preparare i polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo

Abstract

Fonte: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Imaging dal vivo ex vivo delle metastasi polmonari e del loro microambiente, J. Vis. Exp. (2016)

Questo video descrive un metodo di preparazione dei polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo per studiare le interazioni tra cellule tumorali e cellule stromali, utilizzando l'agarosio per l'inflazione. Nel protocollo del campione, la procedura di inflazione dell'agarosio viene descritta prima di osservare le interazioni cellulari vive.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Preparazione dei polmoni per l'imaging dal vivo ex vivo

NOTA: Cerca di lavorare il più sterile e attento possibile per evitare inutili sfide alle cellule immunitarie all'interno dei polmoni.

1. Iniettare nel topo per via intraperitoneale (i.p.) un sovradosaggio letale di un anestetico consentito dal protocollo animale approvato da IACUC, ad es. 1 ml di Avertin. Attendi che il topo smetta di respirare e non risponda completamente agli stimoli nocivi (pizzicamento della zampa posteriore).
   NOTA: La lussazione cervicale e l'eutanasia con anidride carbonica dovrebbero essere evitate in quanto possono influire negativamente sulla vitalità delle cellule polmonari.
2. Immobilizzare il topo su una tavola di dissezione e sterilizzare il topo con etanolo al 70%.
3. Usa le forbici chirurgiche per praticare prima un'incisione epigastrica trasversale attraverso la pelle, seguita da un'incisione simile attraverso il peritoneo. Tenere la tavola di dissezione in posizione verticale e tagliare l'aorta discendente, in modo che il sangue si accumuli nell'addome e non nella cavità toracica.
4. Taglia una piccola apertura nel diaframma per rilasciare il vuoto. Tagliare lungo la 10a e la 12a costola per asportare il diaframma e ottenere l'accesso visivo ai polmoni.
5. Usa le forbici chirurgiche per tagliare la pelle fino alla trachea sopra la gabbia toracica, ma lascia intatta la gabbia toracica. Separare la pelle dalla gabbia toracica. Esporre la trachea rimuovendo il tessuto connettivo circostante, facendo attenzione a non danneggiare la trachea stessa (Figura 1A).
6. Praticare una piccola apertura di circa 1 mm di diametro nella trachea esposta parallelamente agli anelli cartilaginei , il più vicino possibile alla laringe (Figura 1B). Fare attenzione a non tagliare completamente la trachea.
7. Prendi un ago da 20 G e inserisci delicatamente l'ago per 4-5 mm nella trachea senza alcuna forza contraria (Figura 1D). L'estremità dell'ago dovrebbe essere visibile attraverso la trachea (Figura 1C). Usa una pinza per stabilizzare l'ago nella trachea. In alternativa, è possibile legare una sutura attorno alla trachea per tenere l'ago in posizione.
   NOTA: Inserendo troppo in profondità, la carena può essere traumatizzata o solo un lato dei polmoni potrebbe essere gonfiato.
8. Riempire una siringa con 400 μl di agarosio a bassa temperatura di fusione al 2% a 37 °C (prelevato direttamente da un bagno a temperatura costante). Assicurarsi che la tavola di dissezione sia in piedi e instillare lentamente l'agarosio caldo attraverso l'ago nei polmoni, utilizzare ~400 μl per gonfiare i polmoni.
   NOTA: Guarda i polmoni che si gonfiano all'interno della gabbia toracica. Non gonfiare eccessivamente il polmone perché si romperà.
9. Una volta che i polmoni sono stati gonfiati, riempiendo ~2/3 della gabbia toracica, staccare la siringa e tenere l'ago all'interno della trachea per evitare perdite di agarosio.
10. Versare circa 50 ml di PBS a 20 °C sui polmoni gonfiati per consentire all'agarosio all'interno dei polmoni di solidificarsi. Rimuovere lentamente l'ago e chiudere la trachea con una pinza per evitare la fuoriuscita di agarosio non solidificato.
11. Esporre i polmoni eseguendo una sternotomia e successivamente asportare i polmoni. Per l'escissione dei polmoni, aggrapparsi alla trachea mentre si taglia completamente la trachea. Tirare delicatamente la trachea verso l'alto, tagliare via il tessuto connettivo e l'esofago mentre si estraggono i polmoni dalla cavità toracica fino a quando i polmoni non si separano dal topo (Figura 1E).
12. Immergere i polmoni in RPMI-1640 caldo per lavare via il sangue in eccesso e separare delicatamente i lobi usando forbici e pinze per tagliare il bronco principale dello stelo principale dei lobi all'ilo (Figura 1F).
13. Posizionare i lobi, con la superficie piana rivolta verso il basso per massimizzare la superficie di imaging, in un pozzetto di una piastra di imaging a 24 pozzetti (Figura 1G). Aggiungere 100 μl di RPMI-1640 a 37 °C sopra i lobi. Posizionare diversi vetrini di copertura del microscopio circolare da 15 mm sopra i lobi per evitare che galleggino.
14. Versare il PBS caldo nei pozzetti circostanti per evitare che il supporto RPMI-1640 evapori. Inserire la piastra a 24 pozzetti nella camera climatica bilanciata e mantenere i lobi polmonari a 37 °C con aria e CO₂ al 5%. Inserire la camera climatica sul tavolino del microscopio confocale.
    NOTA: Potrebbero essere prese in considerazione anche altre miscele di gas (ad esempio, 5% O₂, 5% CO₂ in N₂ per esaminare il comportamento delle celle in condizioni di ipossia/ossigeno inferiore).

Risultati

Figura 1. Protocollo per la preparazione dei polmoni per l'imaging dal vivo.(A) Esposizione della trachea dopo la preparazione del topo. (B) Piccola cesoia praticata nella trachea esposta parallelamente agli anelli cartilaginei . (C) Ago da 20 G inserito 4-5 mm nella trachea. (D) Instillazione polmonare di 400 μ

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anestetico	Na	Na	Anestesia approvata da IACUC, utilizzata per anestesia e/o eutanasia
PBS, USP sterile	Amresco INC	K813-500ML	Grado ultra puro per iniezione endovenosa
1X PBS	Impianto di coltura cellulare UCSF	Na
Piattaforma in polistirolo	Na	Na	Verrà utilizzato come tavola di dissezione
Forbici fini affilate	Strumenti per la scienza	Codice 14060-11
20 g x 1 ago, smusso corto	Bd	305178
forcipe	Negozio di chirurgia Roboz	RS-5135
Siringa da 1 mL senza ago	Bd	309659
Agarosio a bassa temperatura di fusione	Lonza	Codice: 50111	Per ottenere 10 ml di soluzione, pesare 0,2 g di agarosio, aggiungere a 10 ml 1 x PBS e scaldare per sciogliere. L'agarosio si solidifica a temperatura ambiente, quindi si mantiene a bagnomaria a 37 °C fino al momento del gonfiaggio.
RPMI-1640 medio senza rosso fenolo	Tecnologie per la vita	Codice 11835-030
Piastra ai fosfori a 24 pozzetti	E&K scientifico	EK-42892
Vetrini di copertura, 15 mm	Fisher Scientifico	Codice 22-031-144
Regolatore digitale di CO2 e temperatura	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Camera climatica	Okolab	Na	http://www.oko-lab.com
Microscopio confocale a disco rotante Cell Observer	Zeiss	Na
aria	UCSF	Na
ossigeno	UCSF	Na
diossido di carbonio	UCSF	Na