1. Passaggio e coltura di cellule TUM622 in colture 2D
- Terreno di coltura 3D caldo e reagenti di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) per cellule TUM622 a 37 °C.
- Passaggio di celle TUM622 all'80% di confluenza in fiasche 2D. Di solito, questo si verifica 1 settimana dopo il passaggio.
- Eliminare il vecchio terreno da un matraccio T75 e lavare una volta con 6 ml di tampone HEPES. Evitare di pipettare direttamente sulle cellule.
- Aspirare il tampone HEPES. Aggiungere 4 mL di tripsina/EDTA (0,25 mg/mL, vedere la Tabella dei materiali) per un rapido risciacquo ed eliminare la tripsina/EDTA.
- Aggiungere 2 mL di tripsina/EDTA e incubare a 37 °C per 5 minuti. Estrarre i flaconi dall'incubatore e picchiettare i flaconi per allentare le cellule senza creare bolle d'aria e rimettere i flaconi nell'incubatore per altri 5 minuti
nota: L'esposizione prolungata alla tripsina danneggerà irreversibilmente le cellule e altererà il loro fenotipo, quindi si raccomanda di limitare il tempo in cui le cellule sono esposte alla tripsina.
- Verificare che le cellule si siano staccate e dissociate al microscopio ottico (4x o 10x). Aggiungere 4 mL di tampone di neutralizzazione (tampone TNS) (vedere le informazioni sui reagenti di sottocoltura nella Tabella dei materiali) seguiti da 10 mL di terreno di coltura 3D (vedere la Tabella dei materiali).
- Pipettare delicatamente su e giù per dissociare ulteriormente le cellule utilizzando una pipetta da 10 ml. Trasferire la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da 50 mL.
- Conta il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
- Seminare 0,8 x 106 cellule/Pallone T75 in 20 mL di terreno di coltura 3D (vedi Tabella dei materiali).
- Nutrire le cellule a giorni alterni sostituendo metà del terreno esaurito con terreno fresco.
2. Placcatura delle cellule TUM622 nella matrice extracellulare per la coltura 3D
- Il giorno prima dell'esperimento, scongelare le fiale della matrice della membrana basale in un frigorifero a 4 °C per una notte. Raffreddamento delle pipette in plastica (2 mL) e dei puntali a -20 °C durante la notte.
nota: Non tutti i lotti di matrice di membrana basale hanno la stessa capacità di supportare la crescita 3D delle cellule TUM622. Pertanto, è necessario acquisire e testare più lotti di matrice di membrana basale per identificare quelli che supportano la formazione di acini robusti. Di solito, ciò richiede una maggiore concentrazione proteica (16-18 mg/mL) nella matrice.
- Il giorno dell'esperimento, riscaldare il terreno di coltura 3D, il tampone HEPES, la tripsina/EDTA e il tampone di neutralizzazione della tripsina (TNS) in un bagno d'acqua a 37 °C. Immediatamente prima di impostare la coltura, estrarre dal frigorifero la matrice della membrana del basamento scongelata e mettere la fiala sul ghiaccio.
- Raffreddare le piastre di coltura tissutale su un dispositivo di raffreddamento con piattaforma metallica posizionato sul ghiaccio. Posizionare le provette da centrifuga su una griglia di raffreddamento in metallo su ghiaccio.
- Utilizzando le celle TUM622 ottenute dal passaggio 1.7, calcolare il numero desiderato di celle necessarie per la placcatura. In genere, sono necessarie 15.000-30.0000 celle per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Una densità più bassa è più adatta per l'imaging e la quantificazione, mentre una densità più elevata è preferita quando si raccolgono cellule per l'estrazione dell'RNA o il western blotting.
- Trasferire la sospensione delle celle in una provetta da centrifuga raffreddata (ciascuna provetta contiene le celle per la triplicazione della placcatura) e centrifugare a 300 x g in una centrifuga a secchio sospeso a 4 °C per 5 minuti.
- Aspirare con cautela il surnatante con una pipetta di aspirazione collegata a un puntale non filtrato (20 μl), lasciando circa 100 μl di terreno nella provetta (utilizzare i contrassegni sulla provetta come guida).
- Picchiettare delicatamente sul lato del tubo per rimuovere e dissociare il pellet prima di rimetterlo nella griglia di raffreddamento.
- Utilizzando le pipette preraffreddate da 2 mL, mescolare delicatamente la matrice pipettando su e giù alcune volte mantenendo la fiala a contatto con il ghiaccio. Pipettare a una velocità uniforme e moderata in modo che durante questa procedura non vengano introdotte bolle nella matrice.
- Trasferire il volume appropriato della matrice in ciascuna provetta da centrifuga. Per la placcatura in triplicati in una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 1,1 mL di matrice a membrana basale a ciascuna provetta.
- Utilizzando puntali pre-raffreddati, pipettare la matrice in ciascuna provetta su e giù circa 10 volte per ottenere una sospensione cellulare uniforme.
- Trasferire 310 μL di sospensione di cellule/matrice in ciascun pozzetto di una piastra preraffreddata a 24 pozzetti. La pipetta viene posizionata con un angolo di 90° rispetto alla superficie della piastra e la sospensione viene aggiunta al centro del pozzetto. La sospensione dovrebbe allargarsi e coprire l'intero pozzetto senza bisogno di inclinare la piastra.
- Per facilitare l'analisi dell'immunofluorescenza a valle, placcare la sospensione cellula/matrice in parallelo in vetrini da camera a 2 pozzetti. Trasferire 100 μl di sospensione di cellule/matrici al centro di un pozzetto di vetrino a camera a 2 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Ciò consente alla matrice di formare una struttura a cupola con un volume molto più piccolo.
- Rimettere la piastra e la camera di scorrimento in un incubatore di coltura tissutale e incubare per 30 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi. Esaminare la piastra/vetrino al microscopio ottico per assicurarsi che le singole cellule siano distribuite uniformemente all'interno della matrice (4x o 10x).
- Aggiungere 1 mL di terreno di coltura 3D preriscaldato in ciascun pozzetto e 1,5 mL di terreno di coltura 3D in ciascun pozzetto del vetrino della camera, quindi rimetterli nell'incubatore.
