Saggio di estrazione dell'RNA: un metodo per estrarre l'RNA dalle cellule tumorali del polmone trasfettate con miRNA

Abstract

Fonte: Hossian, A. K. M. N. et al., Analisi dei trattamenti combinatoriali con miRNA per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive il protocollo di estrazione dell'RNA da cellule tumorali polmonari trasfettate con miRNA. Questo approccio può essere utilizzato per identificare un'attività combinatoria di trattamento con miRNA nell'arresto del ciclo cellulare e dell'angiogenesi.

Protocollo

1. Trasfezione miR-143 e miR-506

ATTENZIONE: Usa guanti in lattice, occhiali protettivi e un camice da laboratorio durante l'esecuzione degli esperimenti descritti. Quando necessario, utilizzare la cabina di biosicurezza con la ventola accesa, senza ostruire le vie aeree o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di protezione in vetro all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.

1. Seminare le cellule NSCLC A549 in un pallone T25 cm²/piastra a 6/96 pozzetti in terreno DMEM/F12K integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (terreno di coltura) in una cappa di coltura tissutale e incubare per una notte a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore per colture tissutali.
2. Sospendere i mimici di miR-143 e/o miR-506 o codificare il siRNA con l'agente di trasfezione (2,4 μg di miR sono stati miscelati con 14 μL di agente di trasfezione; vedere la Tabella dei materiali) in 500 μL di terreno di trasfezione e 1,5 mL di siero e terreni DMEM/F12K privi di antibiotici a una concentrazione finale di miRNA di 100 nM. La quantità di miRNA può richiedere l'ottimizzazione su diverse cellule e concentrazioni. Gli approcci appropriati includono la trasfezione di cellule con concentrazioni crescenti di miRNA (cioè 50-200 nM) e la valutazione della sottoregolazione dell'espressione dei geni di interesse.
3. Rimuovere il terreno di coltura dal pallone/piastra e lavare una volta con 1x PBS.
4. Aggiungere complessi di miRNA/agenti di trasfezione scramble e incubare a 37 °C con CO₂ al 5% per 6 ore (la dimensione del pallone definisce il volume di incubazione aggiunto).
5. Sostituire il terreno con 4 mL di terreno di coltura e incubare le cellule per 24 ore e/o 48 ore.
6. Raccogliere le cellule trasfettate mediante tripsinizzazione, aggiungendo 1 mL di tripsina-EDTA in ogni pallone da² cm T25 cm, incubare per 5-10 minuti a 37 °C e aggiungere 3 mL di terreno di coltura per raccogliere le cellule. Mettere il contenuto di ciascun pallone in una provetta da 15 ml separata e contrassegnata. Lavora in una cappa per coltura tissutale.
7. Centrifugare a 751 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
   nota: È necessaria cautela durante la rimozione del surnatante, poiché l'agitazione della provetta può causare la perdita di cellule.
8. Aggiungere 2 mL di 1x PBS e centrifugare per 5 minuti a 751 x g.
9. Ripetere i passaggi 7 e 8 una volta per rimuovere eventuali tracce di terreno e surnatante.
   nota: In questa fase, le provette per campioni possono essere conservate a -80 °C o possono essere utilizzate immediatamente.

2. Estrazione dell'RNA

1. Pulire l'area di lavoro spruzzando con alcol isopropilico al 70% e soluzione decontaminante RNAsi.
2. L'estrazione dell'RNA deve essere eseguita utilizzando un kit di RNA appropriato (vedere la Tabella dei materiali).
3. Togliere i tubi da -80 °C e lasciarli scongelare. Aggiungere 300 μl di tampone di lisi e pipettare su e giù per rompere la membrana cellulare.
4. Aggiungere un volume uguale di etanolo ultrapuro al 100%.
5. Mescolare bene e mettere nella colonna di separazione.
6. Centrifugare tra 11 e 16 x g per 30 s e rimuovere il flusso.
7. Aggiungere 400 μl di tampone di lavaggio e centrifugare per rimuovere il tampone.
8. Aggiungere 5 μL di DNAsi I con 75 μL di tampone di digestione del DNA in ciascun campione e incubare per 15 minuti.
9. Lavare il campione con 400 μL di tampone di preparazione dell'RNA.
10. Lavare 2 volte con tampone di lavaggio RNA.
11. Aggiungere acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifugare, quindi raccogliere l'RNA.
12. Misurare la concentrazione totale di RNA con uno spettrofotometro UV.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
A549 Cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule	ATCC	ATCC CCL-185
Ambion Silenziatore Controllo Negativo n. 1 siRNA	Ambion	AM4611
has-miR-143-3p miRNA Mimic	Abm	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mimic	Abm	MCH02824
Siero fetale bovino (FBS)	Fisher Scientifico	10438026
Soluzione salina tamponata con fosfato HyClone (PBS)	Fisher Scientifico	SH30256FS
DMEM 4,5 g/L di glucosio, senza piruvato di sodio, con L-glutammina	VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNasi/ Acqua distillata senza RNasi	Invitrogen	10-977-015
Kit a RNA rapido	Ricerca Zymo	R1055
Etanolo, assoluto (200 proof), grado di biologia molecolare,	Fisher BioReagenti	BP2818500
-80 °C Congelatore	VWR	VWR40086A
Nanogoccia	Termo Scientifico	NanoDrop uno C
Piastra a 96 pozzetti	CELLTREAT Scientifico	50-607-511
Penicillina-streptomicina 10/10	Biologici di Antlanta	B21210
Incubatore a CO2	Termo Scientifico	HERAcell 150i
dnasi	Ricerca Zymo	E1010
Miscela di nutrienti F-12K (Kaighn's Mod.) con L-glutammina, Corning	Corning	45000-354
Siero Fetale Bovino - Premium	Biologici di Antlanta	S11150
Centrifuga a temperatura controllata matchina	Termo Scientifico	ST16R
Matchina per microcentrifuga a temperatura controllata	Eppendrof	5415R